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第一章　先天性巨结肠症手术治疗发展历史

先天性巨结肠症（Hirschsprung's disease，HD）是新生儿肠梗阻和儿童便秘最常见的原因，发病率位于先天性消化道畸形的第2位。我国是世界上HD高发国家之一，在新生儿中为1/3 000。人类从对HD的认识到治疗经历了三个多世纪。近一个世纪特别是近30年，HD的治疗取得了突飞猛进的发展。以下将分4个阶段讲述HD手术发展史。

一、症状描述和对症治疗阶段（1691年开始，经历近2个世纪）

对HD的研究起源于欧洲。最早对HD进行描述的是荷兰解剖学家Fredericus Ruysch。1691年，他报道了1例诉腹胀、腹痛的5岁女童，经排气、止痛及杀虫等常规治疗后虽有暂时的症状缓解，但最终治疗无效而死亡。该患儿出生时信息不完整，尸检报告发现巨大而扩张的结肠，但没有其他详细的描述。尽管这可能是第1例描述的HD病例，但是诊断证据不够充分。

1869年，意大利Jacobi报道了2例新生儿肠梗阻，高度怀疑HD，其中1例患儿经过灌肠治疗后恢复，另外1例患儿行结肠造瘘术后症状完全消失，但却死于继发性腹膜炎，尸检时发现没有肠道梗阻，而且扩张结肠消失。Jacobi是第1位应用外科手术治疗HD的医生，但其目的仅是对症治疗、缓解梗阻。

之后的15年，有3位医生对HD的大体解剖进行了越来越具体的描述。

1884年，Gee在1例4岁患儿的尸检中发现HD可能与直肠、乙状结肠“痉挛”有关。

1885年，Bristowe描述了1例8岁女童因长期便秘死于肠梗阻的发病过程，尸检显示其结肠及距离肛门5.08cm以上的直肠上段扩张，没有肛门狭窄。

最著名的是1886年丹麦路易斯女王儿童医院的儿科医生Hirschsprung在柏林的儿科学会议上做的最简明而生动的描述，其论文题为“结肠扩张及肥大导致新生儿便秘”。当时他未注意到先前与该疾病相关的报道，他提供了2例出生后不久即出现便秘症状并最终分别于11个月和8个月时死亡的男性患儿的病例报道。第1例患儿出生后不能排便，依靠灌肠缓解梗阻症状。尽管采取了母乳喂养和泻药治疗，但在随后数个月里便秘持续存在。8个月时住院，经2个月的精心治疗，患儿仍无自主肠道运动，腹胀明显。肠道运动受激发后则腹胀减轻。出院后，患儿仍腹胀并频繁排稀便，出现体重快速下降，再次入院治疗，于11个月时死亡。尸检显示乙状结肠和横结肠高度扩张，肠管肌层肥厚，直肠未见扩张或狭窄。第2例患儿同样于出生后出现便秘，直肠指诊显示直肠空虚，8个月时死于严重腹胀及腹泻，考虑可能是先天性巨结肠相关小肠结肠炎（Hirschsprung-associated enterocolitis，HAEC）。尸检发现结肠的表现与第1例患儿相似，但是尸检没有描述直肠。1888年Hirschsprung发表了这2例病例报道，当时既未说明该病的病因，也未提供该病的治疗方法。

1908年和1915年，Finney和Ward分别报道了切除扩张肠段并取得“暂时的治疗成功”。1945年，第二次世界大战结束，多项研究成果明显加快了小儿HD的研究进程。

二、根治性手术阶段（1948年开始，经历40余年）

这一阶段，新术式层出不穷，术后不良并发症使手术方式不断改进。1948年，美国Swenson和Pickett及Neuhauser采用钡剂灌肠和X线透视方法观察到HD患儿的直肠或乙状结肠存在痉挛肠段，并确定该痉挛段为梗阻部位，这是Swenson医生对HD的第1个贡献。

同年Swenson等对6例患儿实施了近端结肠造瘘术，但3例患儿在关闭造瘘口后梗阻症状复发。这一现象促成了一种新手术方式的出现：于腹腔内游离结肠和直肠，切除扩张的结肠和狭窄的直肠，封闭近端；然后经肛门将结肠和直肠外翻拖出，于肛门外进行环形吻合。这是HD治疗史上划时代意义的事件，即治疗HD第1个成功的手术方式——Swenson手术，这是Swenson对HD的第2个贡献。该术式首先在波士顿儿童医院用于外科实验室动物，随后应用于临床。Swenson在对患儿25年的随访中没有发现勃起功能障碍和尿失禁发生，其中1.4%患儿需要肠造瘘，3.2%的患儿发生持续污便，90%的患儿排便功能正常。但是再无其他医生报道相似的结果（可能是经验或认识上的差异）。

由于Swenson手术盆腔分离广泛，包括直肠前壁、侧壁和后壁，操作复杂，术后吻合口狭窄、尿潴留、盆腔感染、便秘等并发症多，因此，人们继续探索新的手术方式。1952年，美国State报道采用盆腔骶前直肠切除术治疗HD。该术式保留了较多无神经节细胞肠段，便秘复发率高，最终被弃用。1956年，法国Duhamel报道采用直肠后经肛门拖出术治疗HD。该术式是经齿状线上方1cm的直肠后壁处全层切口将正常近端肠管拖至会阴部，盆腔内的解剖只限于直肠后区域，直肠前壁不分离，近端结肠从直肠后壁拖出，降低了排尿神经和勃起神经损伤的可能，但保留了部分无神经节细胞的直肠前壁。该手术对患儿侵袭虽然相对较小，但术后肛门需要拖带钳子，部分患儿出现肛门失禁。而且如果直肠残端保留较长，容易形成闸门或盲袋。这些问题促使医生们对该术式进一步改进，包括改变肛门切口的位置来保留更多的肛门内括约肌，以及完整切除结肠直肠间隔消除盲袋以避免形成粪石梗阻。

1960年，瑞士Grob选择了在直肠后壁齿状线上2.0～2.5cm处做切口，但术后便秘复发率高。法国Pagès则在齿状线上1.5cm处做切口，既避免了大便失禁又避免了便秘的复发。Martin、Ikeda、Soper及Millerji和Steichen等报道了使用各种钳子及吻合器切除或切开无神经节细胞直肠残端后壁和拖出正常肠管前壁构成的结直肠间隔。其中几种改良术式沿用至今，如直肠后结肠拖出、直肠结肠间隔完全切断、直肠结肠“Z”形吻合术（Ikeda术）、肛管后壁缝合、直肠内结肠套出直肠结肠斜形吻合术（赖炳耀手术）、直肠后结肠拖出、直肠结肠前壁钳夹术（张金哲手术）。这些手术应用不同的方法基本消除了盲袋和闸门，治疗效果得到进一步改善。

为了简便操作，1958年，德国Rehbein报道，在行低位骶前直肠切除术后于齿状线上3～4cm做吻合。该术式不解剖盆腔，基本理念是将长段型HD变成短段型HD，配合术后长期扩肛达到治疗效果。然而该术式吻合口瘘和便秘复发率较高，绝大多数医生已基本放弃。

为了进一步减少盆腔操作，1963年，意大利Soave描述了直肠内拖出手术，该手术在盆腔内切开直肠浆肌层向肛门侧剥离直肠黏膜，然后将神经支配正常的肠管通过无神经节细胞的直肠肌鞘拖至会阴部，降低了损伤支配排尿功能和勃起功能的神经的风险。最初Soave手术是将肠管拖出到肛门外，待肠管与肛门附近组织形成粘连后行二期切除及吻合。需要指出：保留直肠肌鞘的方法并不是Soave的首创，澳大利亚Hochenegg曾于1898年描述该方法，Ravitch也于1948年使用该方法治疗1例结肠良性疾病的成年患者，Kiesewetter在治疗高位肛门直肠畸形时也采用了类似的方法。

1964年，Boley进一步改良了Soave手术，他在行经肛门拖出肠管时一期完成吻合。1986年，王果吸取各种手术的优点，设计出一种类似Swenson手术的新术式，即直肠肛管背侧纵切、心形斜口吻合术，并称该手术减少了术后污便、肛门失禁或便秘的发生。

全结肠巨结肠症（total colonic aganglionosis，TCA）的治疗一直在探索之中。1953年，Sandegard首次成功采用结肠切除、回肠肛管吻合术治疗该病，但这种手术的并发症及死亡率大大高于病变累及直肠乙状结肠的典型HD。

为了提高结肠的吸收能力，1968年，美国Martin描述了一种改良的Duhamel拖出术式，该术式保留脾曲以下的无神经节细胞结肠与小肠做侧侧吻合。1981年，Kimura将无神经节细胞的右半结肠制成补片缝合到回肠的系膜对侧面，以达到减慢传输和增加吸收的效果。1984年，Boley采用了左半结肠做补片。1982年，Martin进一步改进了手术方式，他保存并利用了全部的无神经节细胞结肠。然而改进后的手术均可引起严重的HAEC，后来被大多数儿外科医生摒弃。

近10年报道显示，对病变累及末端回肠到中段小肠的TCA患儿，采用标准的改良Duhamel、Soave或Swenson手术治疗均能取得良好的效果。Rintala、Lindahl和Lal认为，采用回肠肛管J袋或S袋手术也可取得良好的效果。

对于累及更近端小肠的神经节细胞缺乏症（近全肠型巨结肠症）的治疗目前仍很谨慎。这些患儿基本上都有短肠综合征，常需要长期全肠外营养（TPN）支持治疗。Escobar、Kimura、Kottmeie及Nishijima等发现采用无神经节细胞肠道切除手术虽然对该类型患儿有益，但会出现缺铁性贫血等远期并发症。1987年，Zieglert提出了无神经节细胞肠段肌切开术（或肌切除术）治疗近全肠段型神经节细胞缺乏症（near total aganglionosis，NTAG）的观念，该类患儿神经支配正常的小肠长度小于40cm。1993年，Ziegler等报道了16例NTAG患儿肌切开术（或肌切除术）的多中心研究结果。10例患儿存活，其中2例可完全依赖肠内营养生活。他们认为肌切开术后的无神经节细胞肠段具有消化和吸收营养的能力，并被视为肠移植的过渡手术。2000年，Saxton等报道了7例NTAG患儿的治疗经验。该学者采用肌切开术和无神经节细胞肠管补片手术，但7例患儿中仅2例存活，术后并发症高，与附加手术有关。

进入20世纪90年代，器官移植的发展使小肠移植成为治疗累及小肠NTAG的可选方法。伴有TPN相关肝衰竭的病例适合做肝肠联合移植。

1995年，美国Starzl团队的Tzakis等报道了1例广泛神经节细胞缺乏症的16岁女童，成功施行了肝肠联合移植，并利用供者的降结肠做了Soave直肠内拖出手术。1998年，Reyes等报道了55例接受小肠移植术的儿童患者中有4例为HD。1999年，法国Enfants Malades医院的Goulet报道了小肠移植的初步临床经验，发现20例患儿中有4例患HD，无神经节细胞病变累及近端空肠。2003年，该医院Revillon等报道了3例成功施行了肝肠联合移植及拖出术（2例Duhamel手术，1例Swenson手术）的广泛神经节细胞缺乏症患儿，患儿术后生活质量获得改善。同年英国Sharif等报道的患有广泛神经节细胞缺乏症（仅有10～50cm的正常空肠）并伴有TPN相关肝衰竭的5例婴儿中，有4例行肝肠联合移植，另外1例行单纯小肠移植，术后有4例取得了成功的疗效。这些学者强调，初次手术要保留无神经节细胞肠管并避免广泛切除肠管以维持腹腔容积，以便今后放入移植物。

HD患儿术前和术后的主要并发症之一是HAEC，这可能是Hirschsprung最初报道（1886年）中婴儿死亡的原因，也是目前HD的主要并发症和死亡原因。Swenson最早强调该并发症在婴儿HD中的重要性（Swenson的第3个贡献）。HAEC是功能性肠梗阻与淤滞的结果，不同报道中HAEC的发生率存在较大差异，主要集中在14%～40%，可能与诊断标准不同有关。

HAEC通常表现为暴发性腹泻（70%）、呕吐（50%）、发热（34%）及嗜睡（27%），腹泻伴有腹胀，提示存在梗阻。在肛窦及结肠黏膜中出现急性炎症细胞浸润，导致肛窦脓肿及黏膜溃疡。确切的发病原因尚不清楚，但黏膜防御机制受损已证明与IgA分泌不足、黏蛋白前体缺乏和MUC-2基因有关。

各种手术方式治疗HD后均可观察到HAEC，但是其在Soave手术后（可能因为无神经节细胞肌鞘的原因）、TCA患儿（特别在Martin改良后的保存全部无神经节细胞结肠的Duhamel拖出术后）及与免疫因子缺陷相关的唐氏综合征的婴儿中发生率更高。这些发现促进了手术方式的进一步改良，如在Soave手术中切开肌鞘后壁及不采用Martin保存全部无神经节细胞结肠的Duhamel拖出术。

近30余年，HD的治疗从多期手术逐步向一期手术的方向发展。1981年，So等首次报道了HD新生儿一期拖出手术，未预先行结肠造口术。1982年，Carcassone等也同样报道了对3月龄以内的患儿行一期手术的经验。这些报道反驳了Swenson提出的婴幼儿早期手术导致并发症和死亡率增加的观点。多因素分析结果显示，一期拖出术与多期拖出术同样安全有效。一期拖出术已经成为治疗HD的标准方法，最近的微创手术使一期拖出术变得更加完善。

三、微创手术治疗阶段（1994年开始，经历了20余年）

微创手术是伴随着腹腔镜手术发展起来的。手术方式更加完美，手术创伤明显减小。20世纪末期，腹腔镜在成人外科得到迅猛发展，且在儿童疾病渐渐得到应用。1994年，Smith等首次应用腹腔镜辅助Duhamel拖出术成功治疗1例2岁HD患儿，该手术避免了开腹。这种手术在腹腔镜下游离结肠和直肠后间隙；然后经右下腹12mm Trocar置入内镜切缝器（Endo-GIA）离断直肠，在齿状线上10mm直肠后壁做12mm全层横切口，置入12mm Trocar和抓钳，腹腔镜监视下拖出近端肠管；接下来完成结肠和直肠后壁的端侧吻合；最后应用Endo-GIA切开结肠直肠间隔。多余的直肠盲袋可通过Endo-GIA切缝器切除，防止形成大盲袋。

腹腔镜辅助Duhamel拖出术操作较复杂，需要腔镜下的切缝器械，世界范围内普及率不高。与经典的开腹Duhamel拖出术一样，腹腔镜Duhamel拖出术技术要点仍然是直肠盲袋和结肠直肠间隔的处理，操作上与开腹手术有所不同。为了获得短直肠袋，2012年Nah采用直肠脱垂肛门外横断直肠；Lamas-Pinheiro采用可转弯的内镜切缝器，经肛门置于直肠后，低位横断直肠。

腔镜手术也能完成结肠直肠间隔的完全切除。2012年，日本Urushihara报道了经肛门直肠后反折拖出直肠，于肛门外横断直肠，然后腔镜下经肛门完全切断结肠直肠间隔，并经盆腔完成直肠结肠前壁缝合。然而这些手术方式操作复杂，并且盆腔存在污染或感染，限制了临床的应用。2012年，汤绍涛团队将Urushihara术进行了改进，即经肛门直肠后拖出直肠，肛门外横断直肠，保留直肠的长度为4.5～5.5cm，然后应用“紧顶技术”完成结肠直肠间隔切除，简化了操作步骤，缩短了手术时间，减少了盆腔污染或感染并发症，使腹腔镜Duhamel拖出术得以常规开展。

1995年，美国Georgeson等报道了腹腔镜辅助Soave直肠内拖出手术，并于1999年将其进一步改进。Georgeson-Soave手术的要点是应用腹腔镜技术完成浆肌层或全层活检和结肠系膜游离，然后经肛门向头侧剥离直肠黏膜，拖下神经节细胞正常肠管与齿状线上直肠黏膜吻合。该手术很快被很多医生接受并喜欢。Georgeson对HD手术治疗的贡献，一是用腔镜技术代替开腹手术实行肠系膜游离和肠壁活检，二是将经盆腔改为经肛门分离直肠黏膜。随着临床应用的不断增多，很多医生认识到因肌鞘狭窄、翻转导致术后梗阻、便秘和HAEC发生率的增加，因此，需要将肌鞘切开或部分切除，手术技术也由最初的长肌鞘向短肌鞘或无肌鞘的方向发展。

1994年，美国Curran首先在杂交犬动物模型进行腹腔镜Swenson手术并获得成功。1996年，Curran应用腹腔镜Swenson手术治疗了8例巨结肠患儿，获得了满意的近期疗效。2003年，澳大利亚Kumar将其改进为一期手术并获得与分期手术同样的疗效。

我国腹腔镜HD手术的开展晚于国外4～5年。2000年，广州的梁伟成和邓建中首先在国内报道了腹腔镜辅助Soave手术。2001年，武汉的汤绍涛团队报道了腹腔镜辅助Swenson手术，北京的陈永卫报道了腹腔镜辅助Duhamel拖出术，同年上海的吴晔明、南京的刘继炎、焦作的慕希才也发表了腹腔镜辅助Soave手术的中文文章。2012年，汤绍涛在J Laparoendosc Adv Surg Tech A杂志上发表了218例腹腔镜Soave手术治疗经验，是当时世界上单中心单个医生的最多病例报道。

Rinatala和Lindahl描述的也是一种经肛门的拖出术式，但游离近端结肠是通过开腹手术完成的。受美国Georgeson、芬兰Rinatala和Lindahl的启发，墨西哥的de la Torre-Mondregon在临床实践中发现，单纯经肛门也能完成典型巨结肠的切除和Soave吻合术，其成果于1998年发表在Journal of Pediatric Surgery。

自此以后，经肛门Soave手术被Langer、Albanese等及Teitelbaum等应用于新生儿HD治疗。欧洲、北美洲及非洲的3个多中心研究结果也支持该手术的应用。该技术比腹腔镜手术对患儿创伤更小，多中心荟萃分析显示疗效与腹腔镜手术相似，但少数报道认为单纯经肛门手术肛门括约肌牵拉损伤大，术后排便频率多于腹腔镜手术。

国内单纯经肛门拖出手术与腹腔镜手术几乎同时起步。2001年，西安的高亚、上海的郑珊和南京易军分别在国内报道了单纯经肛门Soave手术，取得了满意的近期疗效，而高亚也是最早将单纯经肛门手术的论文发表在Journal of Pediatric Surgery的中国医生。

2009年，泰国的Sookpotarom、中国的金先庆相继报道了经肛门Swenson手术，操作的主要不同是经肛门Soave手术齿状线以上分离的是直肠黏膜，而经肛门Swenson手术齿状线以上分离的是直肠全层，出血少，但对直肠周围组织如神经、尿道、阴道等有潜在的损伤机会，远期排便功能有待于观察。由于腹腔镜辅助拖出手术和单纯经肛门拖出手术创伤更小，使新生儿时期接受手术的HD患儿也越来越多，减少了家庭压力，减轻了患儿痛苦，也降低了由HD引起的相应并发症的发生率。

2000年，da Vinci机器人诞生于Intuitive Surgical公司，此手术系统随后广泛应用于泌尿外科、心外科、妇科、普外科等成人微创手术。由于机器人手术系统操作器械相对较大，小儿腹腔容积较小，机械手操作空间有限，da Vinci机器人手术系统在小儿外科应用受到限制，仅在国外有少量报道。

2001年，德国Meininger等首次报道了小儿da Vinci机器人手术（胃底折叠术）。2011年，美国Hebra报道da Vinci机器人辅助巨结肠Swenson拖出术。第1位将da Vinci机器人引入我国小儿外科的是香港大学玛丽医院的黄格元，2013年，他们应用da Vinci机器人完成了20例小儿外科手术，患儿平均年龄10.7岁，包括6种疾病，最多的是胃底折叠术，但没有HD手术。2016年，汤绍涛团队首先在国内报道了3例da Vinci机器人治疗HD手术，其显著的优势是从盆腔浆膜下解剖全部直肠，减轻了直肠周围神经、血管损伤的同时进一步减少了肛门括约肌的牵拉性损伤。根据汤绍涛团队的经验，da Vinci机器人适合于各种年龄的患儿。

2009年，Keckler统计了美国270名小儿外科医生开展HD手术的情况，80%的医生采用微创手术，其中42.3%的医生应用腹腔镜技术，37.7%的医生经肛门手术，只有5.4%的医生应用开腹Duhamel拖出术。2016年，全日本基于患儿的调查显示，96.5%的HD患儿接受微创手术，其中49.6%接受经肛门手术，36.9%接受腹腔镜技术。2016年，欧洲小儿外科学会基于医生的调查显示，83.5%的医生应用微创手术治疗HD，其中57.2%采用经肛门手术，26.3%采用腹腔镜技术。可见，微创手术已经成为HD治疗的主要方法。

腹腔镜辅助Soave手术、Duhamel拖出术及Swenson手术均取得了令人满意的结果，与传统开腹手术相比，前者疼痛轻、美容效果好、疗效相当或更优。尽管大部分患儿术后恢复良好，但是除了之前提到的HAEC外，部分患儿仍存在便秘复发问题。其中包括将神经支配正常的近端结肠拖出后出现的“获得性”神经节细胞缺乏症，可能与拖出肠管缺血有关，再次行拖出手术则有很好的效果。同样，少数因术后狭窄而疗效差或顽固性便秘的患儿，也需要再次行拖出手术。持续的排便问题可以采用肛门内括约肌切开术、直肠肌切开术（肌切除术）、肉毒杆菌毒素注射及局部应用一氧化氮（NO）等方法进行治疗。

2016年，Puri团队发表了2篇荟萃分析文章，通过总结20余年的微创手术经验显示，腹腔镜和单纯经肛门手术虽然创伤明显小于开腹手术，但腹腔镜手术仍然有1/3患儿存在长期排便问题，而单纯经肛门手术有15%或更多的患儿有便秘复发。

TCA是HD的严重类型，目前有关该类型治疗的手术方式尚未达成共识，经典Martin术、Kimura术和J-pouch术相对于Swenson、Soave和Duhamel手术虽然减少了术后腹泻、肛周溃烂等并发症，但术后HAEC、梗阻、盲袋炎发生率高，且操作复杂，现已很少应用或放弃。Peña建议采用回肠肛门直接吻合（Soave和Swenson手术），保留末端回肠造口3～5年，排便功能更好。而南非的Moore等认为改良Duhamel拖出术可以获得更加满意的长期排便功能。

将腹腔镜技术应用于TCA的治疗起步晚，推广慢。2011年，法国de Lagausie等报道了腹腔镜Duhamel拖出术和Soave手术治疗TCA。2013年，日本Miyano报道了腹腔镜Duhamel拖出术治疗TCA并与开放Duhamel拖出术比较，认为腹腔镜Duhamel拖出术安全、可行、美容效果好，但手术时间长，平均需要5～6小时。2017年，汤绍涛报道了腹腔镜Duhamel拖出术治疗TCA，应用脐部造口游离部分肠管，然后经脐部放入Trocar完成腹腔镜左半结肠切除手术，肛门外横断直肠，“紧顶技术”完成肠管间隔的切除，手术时间从5～6小时缩短至2～3小时，并认为5cm左右的直肠盲袋既降低了排便频率，减少了肛周皮肤破溃的发生率，又避免了盲袋炎，同时降低了HAEC的发生率，同时腹壁的美容效果可与一期腹腔镜手术媲美。

100多年前，HD被认为是不可治愈的，患儿最终均会死亡。随着手术技术的进步，其死亡率在20世纪40年代为70%，20世纪70年代降到25%，到20世纪90年代90%以上的患儿可存活。目前，在大多数医疗条件先进的地区，HD患儿的生存率达95%以上。与此同时，随着腹腔镜技术和经肛门手术的应用，患儿腹壁美容效果、住院时间、术后并发症得到明显改善。

尽管如此，仍有许多地方有待进一步研究，如有些HD患儿手术治疗后预后较差的原因，HAEC的发病机制，治疗变异型HD患儿（先天性巨结肠同源病）的合理方法。对肠神经系统（enteric nervous system，ENS）及此类疾病分子遗传学的深入研究会为解决这些问题提供线索，并有助于更好地为患儿选择治疗措施。

四、未来的基因治疗阶段（细胞实验和动物实验阶段）

HD发病的本质即基因突变导致ENS发育缺陷，过去20余年科学家们对HD相关的遗传变异进行了深入研究。1992年，意大利研究团队鉴定出第1个HD易感基因——RET基因，并被后续大量研究所证实。RET信号通路在ENS的发育过程中极为重要，影响ENS形成的多个方面。约50%的家族性及1/3的散发性HD存在RET编码区的突变。1994年，Puffenberger发现另一个基因EDNRB在ENS发育过程中也发挥重要作用，以往认为EDNRB通路是独立的信号通路，现发现其与RET通路存在交互作用，仅5%的HD患儿携带EDNRB基因杂合子突变；而其他与HD相关的基因突变更加少见，有时仅见于1个家族。随着研究的进一步深入，新的相关基因在不断被发现。

作为HD高发生率国家，我国科学家在HD基因方面的研究取得了瞩目的成就，谭广亨团队在这方面的工作尤为突出。缪小平等通过病例-对照关联研究，发现PHOX2B基因IVS2+100G ＞ A明显增加HD的患病风险。2009年，谭广亨团队通过全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）在我国人群中发现1个新的HD易感基因NRG1，其单核苷酸多态性位点rs7835688［优势比（odds ratio，OR）=1.98］和rs16879552（OR=1.68）与HD发病密切相关。然而荟萃分析显示中国人群NRG1常见的单核苷酸多态性位点（rs7835688，rs16879552），与欧洲人群HD并无明显关系，反映出了HD遗传背景的种族差异。其后汤绍涛等通过病例-对照分子流行病学研究证实，位于NRG1基因的单核苷酸多态性位点rs2439302与我国人群HD发病风险明显相关。动物实验（以斑马鱼为模型）显示敲低NRG1后肠神经元从头端至尾端的迁移过程受阻，并且影响了迷走神经纤维由肠道近端向远端延伸过程。

通过对1个国人HD家系（母子均患病）进行全外显子测序并运用疾病网络分析研究，发现NRG家族的另外一个基因NRG3亦与HD发病关系密切。姜茜等通过GWAS研究，发现轴突导向因子SEMA3C/SEMA3D在ENS发育过程中起着关键作用，其单核苷酸多态性位点rs11766001、rs12707682变异明显增加HD的患病风险。进一步研究发现，SEMA3C/SEMA3D错义突变严重影响其蛋白的表达量而妨碍蛋白功能的正常发挥，从而引发HD表型。蔡威团队通过病例-对照模型定点研究了PTCH1基因与我国汉族人群HD患病风险的关系，发现该基因单核苷酸多态性位点rs357565、rs2236405与我国人群罹患HD相关。

最近谭广亨团队联合中国和越南10多家医院，应用443例短段型HD标本采用全基因组测序，发现BACE2基因突变与HD发病相关。李爱武等认为，HD是基因异常与肠壁微环境异常共同作用的结果。研究表明，Neuroligin-I与Neurexin Ⅱ表达失调可影响ENS发育，导致HD表型。

2代测序的发展为HD易感基因的研究提供了有力手段。最近谭广亨及唐维兵团队相继通过全外显子测序发现新的HD易感基因DENND3、NCLN、NUP98、TBATA、COMT和ARVCF，并通过细胞或动物模型进行了功能验证，具有很好的临床应用前景。此外，唐维兵等对miRNA（非编码基因）在肠神经嵴细胞迁移、分化的影响方面做了大量卓有成效的研究。夏慧敏团队历时10年，收集了1 470份HD患儿样本，同时收集1 473例正常患儿样本作为对照，通过基因组关联性研究，发现了HD新的易感基因IRAK1，初步功能验证表明该基因可能与RET相互作用调控ENS的发育。同时，该团队利用2 943例病例对RET基因的16个易感位点在中国人群进行了验证。

通过HD病变组织与正常组织基因表达差异来确定HD易感基因也是目前的研究方向之一。金先庆等发现，HD痉挛段HA117 mRNA表达明显增高，该基因与HD发病高度相关。江逊等利用RNA芯片技术，通过差异筛选法筛选出HD相关基因PTPRR，后期功能实验发现，该基因对于维持ENCC处于干细胞状态至关重要。高亚等通过优化生物信息分析流程，从RNA芯片数据中筛选出HD相关的候选基因（FOS、EGR1、ATF3、NOS1、CCL5、DUSP1、CXCL3、VIP、FOSB），为进一步功能验证奠定了基础。我国学者对HD患病基因的研究对推动HD的防治作出了巨大贡献。

对HD遗传变异的深入研究给该疾病的基因治疗带来了新的契机。迄今为止，已确定15个以上基因与HD的发病密切相关，分别有RET、EDNRB、GDNF、ECE1、GFRα1、NRG1、PHOX2B、NRTN、TCF4、SOX10、EDN3、NTN、PSPN、ZFHX1B、L1CAM、Semaphorin 3C/D等。这些基因主要编码与ENS发育相关的配体、受体、转录因子及细胞外基质的关键成分。如果能使远端无神经节细胞的病变肠管重新获得神经支配，并形成有效的蠕动，那么肠道将恢复正常的功能。目前已有大量文献从干细胞及组织工程层面通过体外实验及动物模型进行研究，试图通过引入具有正常遗传背景的肠神经干细胞或体外培育的肠道类器官来修复替代病变肠管，从而达到完全治愈HD的目的。

HD的基因治疗首先要解决的问题是获得肠神经干细胞，即“种子细胞”。1992年，Stemple等首次从小鼠胚胎分离出一种p75+的神经嵴细胞（enteral neural crest cell，ENCC），该细胞亚群具有自我更新及多向分化能力，能分化为肠神经元及神经胶质细胞，因此，被称作肠神经干细胞，也叫ENCC。随后的研究着重通过优化筛选特异性的表面标记从迁移后的ENS细胞谱系中分离出ENCC，然后加入特殊的生长因子诱导得到感兴趣的细胞。

在能够获得足够数量的ENCC后，研究者开始将目光投向HD的细胞替代治疗。细胞移植的初期实验主要为向培养的小鼠胃肠道组织注入少量干细胞，然后观察其生物学行为。研究表明，无论是野生型小鼠，还是Ret-/-无神经节细胞小鼠，其胚胎原始胃基壁内注入Ret+ ENCC后均可分化为神经元及神经胶质细胞。进一步的体内移植实验证实，向出生后的SOX10缺陷无神经节小鼠肠壁注射ENCC，7日后在黏膜下层找新生的神经节细胞，为HD的细胞治疗带来了希望。

2009年，Metzger等通过内镜获得健康小儿肠道黏膜组织，并从中分离出ENCC，将得到的ENCC通过显微注射到鸡的无神经节细胞肠壁，与对照组相比，其肌间及黏膜下形成了大量的神经丛。随后，研究者对HD患儿的切除肠管进行了体外组织培养，随后将ENCC移植到培养的组织中。结果发现，数日后移植组的病变肠管组织内以ENCC细胞球体为中心开始出现神经发生，1周后新生的神经元之间出现广泛的神经连接并形成神经丛。该研究的意义在于从人体肠道黏膜组织获得ENCC，为将来HD细胞治疗真正进入临床奠定了基础。

然而，异体细胞体内移植面临一个最大的问题，即免疫排斥，这一问题也出现在动物模型。最理想的方式是从患儿自身有神经节细胞的肠段提取ENCC作为“种子细胞”。但由于HD患儿携带突变基因，这些突变同样存在于提取的ENCC中，很大程度上可能影响其形成ENS的能力。近年来兴起的CRISPR/Cas9基因编辑技术为解决这一难题提供了新的手段。研究人员从1例TCA患儿身上诱导多能干细胞系，该细胞系存在RET G731del突变；又从2例无RET突变但存在VCL M209L突变的典型HD患儿身上诱导多能干细胞系，以IMR90作为对照细胞系。然后利用基因编辑技术修复干细胞系中存在的RET G731del和VCL M209L突变。结果发现，修复后的ENCC恢复了分化迁移的能力。该研究突破了异体移植带来的免疫排斥相关问题。

目前，另外一个前沿技术是通过组织工程技术在体外培育肠道类器官，然后通过整体器官移植的方式替代HD病变肠管。该方法适合于长段型HD或TCA，而干细胞移植主要适合于短段型HD，二者可互为补充。

相关基因的基础研究让我们对HD有了更深入的理解。展望未来，或许可以在明确HD患儿突变基因的情况下，通过基因编辑技术修复突变基因，然后通过细胞移植或组织工程肠道移植的手段治愈HD，真正做到精准、无创。

（汤绍涛）

第一章 先天性巨结肠症手术治疗发展历史

一、症状描述和对症治疗阶段（1691年开始，经历近2个世纪）

二、根治性手术阶段（1948年开始，经历40余年）

三、微创手术治疗阶段（1994年开始，经历了20余年）

四、未来的基因治疗阶段（细胞实验和动物实验阶段）

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