第二章 肠道微生物群培养及分析技术

第一节 肠道微生物群培养技术

研究人员对细菌的培养工作开始于150年前，迄今已可培养并描述约12000种细菌的生长和代谢规律，其中大部分细菌来自环境中，胃肠道来源的细菌数量不到10%。目前，每年发现的新细菌种类约有600～800种。全球的细菌共有107～109个物种[1]。海洋中细菌和古细菌的总物种丰富度超过37000种，甚至单位面积土壤也可容纳多达54000种细菌。虽然细菌培养的研究工作进展较快，但是相比于地球上的海量细菌，我们仍只能“望菌兴叹”。

肠道微生物群中的40000多种细菌共同生存，对人体的免疫、代谢、生长等过程均产生重要影响。由于肠道微生物群绝大部分为厌氧菌或兼性厌氧菌，其生长环境很难通过体外技术模拟，多数细菌较难培养，在有氧环境下存活时间不超过2小时。据估计，肠道中80%的细菌仍不可培养，导致对这些细菌的生长特性、营养偏好、基因功能等研究工作相对滞后。肠道中70%以上的细菌在结肠部位，而该部位的氧气浓度处于整个消化道的最低水平，肠腔内厌氧菌的数量是好氧菌的100～1000倍。厌氧菌苛刻的营养需求和当前仍不成熟的培养体系，使得肠道微生物群的培养工作成为肠道微生态研究领域的重要瓶颈之一，尚不能满足对未知细菌日益增加的解析需求。近年来，随着肠道微生物群培养技术的日益进步，特别是“培养微生物组学”概念的提出，有望为肠道微生物群的研究工作带来质的突破。

培养微生物组学是培养和鉴定居住在人体肠道中的未知细菌的学科，是微生物学培养技术的重要组成部分。培养微生物组学使工作人员能够培养数百种与人类有关的未知微生物，为宿主和细菌的关系研究提供了崭新的视角。本节将对肠道微生物群培养技术和肠道微生物群体外代谢平台的研究进展进行综述，并探讨培养微生物组学在人类微生物群研究中的应用及其对人类健康的影响。

一、肠道微生物群的样品采集与保存

肠道微生物群处于时刻变化之中，样品采集的时间、部位、重量等都将对菌群的培养和后续分析产生影响。同时，样品运输过程中的时间、温度、基质等均可影响样品到达实验室时菌群的结构状态。由于绝大部分肠道细菌为厌氧菌，用于菌群培养的样品采集和运输过程必须保证相对无氧状态，并保持适宜的温度，同时尽量减少样品的运输时间。

（一）无氧培养基

Stuart和Amies运送培养基是临床微生物学研究中最常用的培养基（见图2-1）[2]。最初，Stuart 开发出特定的运输介质用于病原性和挑剔性物种细菌的保存，尤其是奈瑟菌属（Neisseria）物种[3]。该培养基由甘油磷酸钠（缓冲液）、巯基乙酸钠（可降低氧化还原电位）、半胱氨酸盐酸盐（还原剂）、氯化钙（保持渗透平衡）、亚甲基蓝（氧指示剂）和琼脂（一种固化剂）组成，为半固体培养基。Amies培养基是Stuart培养基的改良版本，它将Stuart培养基中的甘油磷酸用无机磷酸盐和煤代替，从而大大减少了样品运输中革兰氏阴性大肠杆菌的增殖。Stuart和Amies运输介质还可以液体形式保存细菌。

Cary-Blair运送培养液由巯基乙酸钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钙和琼脂组成。它可以制备成无菌的预还原厌氧培养基（PRAS）[4]。Holdeman等人编写的“Anaerobe Laboratory Manual（4th Edition）”［《厌氧生物实验室手册（第四版）》］中，就提及了预还原厌氧灭菌（Prereduced Anaerobically Sterilized，PRAS）方法。预还原厌氧培养基采用脱气过程中再生介质的原理，该过程使介质达到沸点以降低气体的溶解度，从而排出介质中的氧气。

为达到厌氧培养的目的，必须从培养基中清除氧气并防止其重新溶回。常用的物理方法有沸腾法和化学还原法，化学还原法主要通过还原分子（如半胱氨酸、铁、三价钛、柠檬酸盐、抗坏血酸、谷胱甘肽、硫化钠和连二亚硫酸钠等）实现氧和巯基乙酸盐的清除[5]。细菌氧化酶也可通过催化O₂ +H+反应生成H₂O来消耗氧气，可将这种酶冻干后添加到液体、半固体和固体培养基介质中。

（二）无氧包装方式

包装在厌氧菌的保存中发挥着非常重要的作用。Hungate试管长而狭窄的空间可有效限制氧气向介质中扩散；适当浓度的琼脂也可用来限制氧气的扩散。此外，也可通过凡士林和石蜡形成不透气的屏障，该方法已用于PRAS固体培养基的特殊包装（Anaerobe Systems，Inc.，CA，USA）中，此包装能保证良好的厌氧菌隔离，从而用于保存厌氧菌[6]。

（三）无氧的操作及容器

厌氧细菌的培养流程如图2-1所示，培养工具通常有厌氧室、广口瓶、密封袋及厌氧发生器。厌氧室是为接种、测试、培养厌氧细菌提供理想条件而又不破坏厌氧回路的培养体系，它包含5%的氢气（H₂）、5%～10%的二氧化碳（CO₂）和85%～90%的氦气（He）。该培养体系中还含有多种指示剂和催化剂，如氧化还原指示剂、氧气指示剂（刃天青和亚甲蓝最为常用）、可辅助催化以去除残留氧气的钯催化剂等。GasPak罐（生产自 Becton Dickinson公司、BioMérieux公司）、Generbag袋（生产自BioMérieux公司）、厌氧生成袋等也可产生厌氧环境，其性价比较厌氧室更高。GasPak罐系统使用两种片剂进行除氧：①硼氢化钠和柠檬酸；②碳酸氢钠和柠檬酸。产生厌氧条件的另一种方法是排空空气并将气态混合物注入培养系统。厌氧环境还可使用两种经典方法获得，即 Fortner 原理和蜡烛罐。Fortner原理将氧敏感菌株与耗氧菌株共培养，蜡烛罐使用蜡烛燃烧产生的二氧化碳代替氧气，这两种方法目前在一些经济欠发达国家仍被广泛使用。例如，利用蜡烛罐中氧气的快速燃烧和酸化钢丝棉的残留氧清除功能，糖尿病足溃疡中的细菌被成功分离[7]。

二、肠道细菌的分批培养

微生物培养最简单的操作方式是分批培养，即在营养物或选择性生长培养基中培养样品或单个菌株。分批培养研究可对选定的细菌进行选择性富集，比较不同底物上细菌的生长速率和代谢产物，并观察和测量特定物种之间的相互作用。人体内的多数寄居微生物都厌氧，对氧气非常敏感，因此，即使短暂的空气暴露也可能杀死采集样品中的某些物种。为保证这些物种的实验室生长，必须在严格厌氧条件下进行培养，如使用厌氧箱或Hungate试管。瘤胃液、粪便滤液的提取物或短链脂肪酸混合物能被某些肠道细菌用作生长底物，可加入培养基中以促进挑剔肠道微生物种的生长[8]。

分批培养存在较多限制因素，由于生长培养后期营养物质的消耗或有毒副产品的衍生，微生物的生长速度将放缓或停止，故获取实验结果的时间窗口较短。分批培养的主要缺陷是劳动强度大，通常要精心选择培养基配方，且需要复杂的优化过程。人体中的大部分微生物物种，尤其是结肠菌群，目前还没有合适的实验室培养条件，因此，肠道细菌体外培养的瓶颈在于能否获得可用于其生长的营养环境。随着未来微生物培养技术的发展，相信人类微生物群的培养覆盖率将不断提高。近年来，肠道微生物群中的多个新物种已被陆续分离出，特别是高通量培养方法也逐渐被用于肠道细菌的培养研究中[8]。

三、肠道细菌的连续培养

体外连续培养是肠道微生物群培养的一种常见方式。与分批培养相比，连续培养在一个开放系统中进行，培养容器的一端持续提供新鲜的生长培养基/营养物，另一端流出过量的液体，以稀释或排出有毒的代谢产物和死亡细胞。连续培养可达到“稳定状态”，允许研究者在培养系统中对环境条件施加更灵活的控制，同时也可运行相对较长的时间周期。体外发酵培养系统已普遍应用于结肠微生物研究中，多个研究团队通过模拟肠道微生物群在肠腔中的不同位置，在发酵罐系统中设置不同的连续培养阶段，对肠道细菌在肠道环境中的变化进行动态模拟。虽然连续培养技术与分批培养技术相比有了较大的进步，但仍存在明显局限，其中最主要的问题是缺乏与宿主的相互作用。另外，通过连续培养系统得到的研究结果与体内的真实情况相比，尚有不小差距。

四、培养组学技术

肠道微生物群组成复杂、种类众多，而分批培养和连续培养又受限于鉴定效率低、重复率高、耗时长等不利条件，难以满足肠道微生态研究的需要。为此，环境微生物研究领域内的学者率先提出“培养组学”的概念，并将其用于肠道微生物群研究[9]。培养组学利用多元化的培养条件，模拟自然条件下的营养环境，通过不断稀释细菌以获得可培养的单菌落。此外，培养组学借助MALDI-TOF质谱分析和16S rRNA测序分析，可鉴定得到不同菌落的细菌组成。培养组学自2012年被提出以来，已逐步被肠道微生物群研究人员接受，肠道细菌的不可培养率已在过去70%以上的基础上得到大幅度降低。

培养组学的建立得益于无氧培养、选择性培养、高通量筛选等实验技术的发展。最早在20世纪70年代，研究者人员就开始进行肠道微生物群培养的探索性工作，研究饮食对肠道微生物群组成的影响[10]。结果表明，在培养获得的400余种肠道细菌种属中，肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和韦荣氏菌科（Veillonellaceae）细菌最为常见[11]。有趣的是，有些肠道细菌不仅在厌氧条件下生长良好，而且在有氧环境中也可被成功培养，如活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）、变黑普雷沃氏菌（Prevotella nigrescens）、坏死梭形杆菌（Fusobacterium necrophorum）、大芬戈尔德菌（Finegoldia magna）、莫雷梭菌（Solobacterium moorei）和阴道奇异菌（Atopobium vaginae）等。在上述研究中，工作人员在Schaedler琼脂中加入谷胱甘肽和抗坏血酸，在很大程度上克服了氧气残留带来的影响，为厌氧培养技术的建立奠定了基础[12]。

培养组学的一大亮点是将MALDI-TOF质谱分析技术引入到微生物的鉴定工作中。众所周知，基因测序对细菌的鉴定和分类至关重要，但现在通用的16S rRNA基因扩增和测序技术不但耗时长，而且成本高，极大地限制了其在高通量培养工作中的应用。美国学者Wolochow教授曾提出根据化学成分鉴定微生物的理念。1975年，研究人员基于质谱分析技术鉴定出革兰氏阴性菌的特定生物标记物[13]。20世纪80年代，有人提出利用计算机算法将细菌的蛋白质质谱与数据库比对，以实现微生物的种属鉴别。由于当时的生物信息技术相对落后，该假设并没有被充分证实和得到发展。直到2009年，首次报道了在常规临床微生物学实验室中使用MALDI-TOF质谱技术鉴定细菌的属水平和种水平[14]。由于MALDI-TOF质谱分析技术既省时间，又节约成本，且结果可高度重复，已在微生物领域得到广泛应用，MALDI-TOF质谱技术也成为临床微生物学细菌鉴定的参考方法之一[15]。该技术的突破使将培养组学用于人类肠道微生物群等复杂微生态系统的研究成为可能。

培养组学是一种高通量培养方法，能方便地鉴定肠道细菌种类。该方法可提供多种培养条件，使具有不同营养偏好的肠道细菌得以生存。肠道微生物群在被不断稀释后，不同细菌的含量差别逐渐减小，直至最低浓度的样品中完全不能培养细菌。研究发现，使用瘤胃改良液和血液可促进肠道微生物群中劣势菌的增长。在全球首例培养组学研究中，工作人员设置了212种培养条件，获得了30000种以上的菌落，随后通过MALDI-TOF分析，共培养了341种细菌，这些细菌中有一半以上首次在人肠道中被鉴定出，包括31种新细菌和稀有门的物种，如互养菌门（Synergistetes）和异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）[16]。上述研究可确定70种不同的培养条件，其中18种被认为是最佳条件，这些培养条件可用于后续研究中的大批量样品测试[8]。培养组学研究工作流程如图2-2所示。

鉴定前期研究发现但尚未培养的细菌可进一步丰富人类肠道微生物种库的储藏物种。例如，变形杆菌门的嗜微菌种和嗜盐菌种难以用菌群测序技术鉴定，近年来研究人员对二者培养条件的建立开展了大量工作。在样品收集上尽量使用新鲜粪便，并尽可能多地从不同肠道部位取样，可增加对氧敏感细菌的培养概率，而适当地放大培养菌落可获得更多小菌落的细菌种类[17]。目前，最常使用的培养条件是在厌氧条件下将样品与瘤胃液和羊血一起孵育[17]。在培养条件的优化方面，研究人员也尽可能模拟生物环境的真实状态。利用“稀释至空白”（Dilution to Extinction）策略，将肠道细菌稀释分离成单个细胞，以获得低丰度的细菌[18]。基于上述策略，人们已培养出两种临床上的重要细菌，即普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）和嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila），并证实了补充外源黏蛋白对嗜黏蛋白阿克曼菌培养的重要性[19，20]。另外，部分产丁酸细菌如粪杆菌属（Faecalibacterium）、罗氏菌属（Roseburia），以及木糖酵解细菌如肠类杆菌（Bacteroides intestinalis）、多氏拟杆菌（Bacteroides dorei）、肠道罗氏菌（Roseburia intestinalis）等也被成功培养[21]。近年来，通过结合高通量测序方法和多样化培养技术，一种利用微流控技术分离和鉴定细菌种类的新方法被开发出来。利用该方法，一个瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）的新属被鉴定出来[22]。

相比于其他生态系统，培养组学在人类肠道微生物群研究中的应用更为广泛。在培养组学技术建立之前，研究人员使用常规培养手段，仅从人类肠道中鉴定出688个细菌物种和2个古细菌物种。与之形成鲜明对比的是，在首次报道的培养组学研究中，仅一次就培养出1057个原核物种，大大扩展了人类肠道微生物群中的细菌物种[17]。此后，人们利用培养组学技术，又陆续从人类肠道中分离出73个新细菌种，从泌尿道中分离出13个新细菌种，从阴道中分离出15个新细菌种，从呼吸道中分离出9个新细菌种，从皮肤中分离出2个新细菌种，从初乳中分离出1个新细菌种。据不完全统计，培养组学使得人类样本中约23%的细菌种类至少被培养过一次，极大丰富了人类相关细菌物种的数目（目前已达2671种）。培养组学不仅增加了已知的人类相关细菌数量，而且改变了人们描述未知细菌的方法。该技术促成了一种新的细菌分类模式，该细菌分类模式由细菌的基因谱和分子表达谱（MALDI-TOF质谱）两部分组成。为此，研究人员建立起一致的标准来描述新分离的细菌，此标准整合了MALDI-TOF质谱和基因组测序数据，并建立了新的物种编码格式（包括GenBank 16S rRNA登记号和一系列菌株编号），以促进新发现物种的快速传播。

培养组学近年来发展得很快，在该技术的推动下，从人体肠道中分离出的细菌种类增加了两倍以上，使人们能更方便地研究这些细菌的表型和功能。为了进一步评估新分离微生物的生物学功能，16S rRNA基因组测序技术和宏基因组学被应用于接下来的工作中。从测序深度来看，16S rRNA基因组测序技术最低只能检测到属水平，在种水平上则不能辨别。宏基因组学可鉴定到种水平，在一定程度上可弥补16S rRNA测序技术的缺陷。但是，在临床上进行病原菌鉴别时，许多病原菌和肠道共生菌的区别只有在株水平才能表现出来，对此，无论是 16S rRNA基因组测序技术还是宏基因组学技术均无能为力。相比于两种测序技术，培养组学可实现细菌在株水平上的鉴别，因此对于病原菌的分离鉴定有独特的优势。例如，同样是大肠杆菌，肠出血型大肠杆菌（EHEC）和尼斯勒大肠杆菌1917（Escherichia coli Nissle 1917，ECN）是两个不同的菌株，前者是高度致病菌，后者是有益菌[24]。两者仅利用16S rRNA 基因组测序技术将难以分辨，但借助培养组学就可以确认毒素是否分泌，轻松实现两种细菌的鉴别。

培养组学还可应用于临床疾病的细菌疗法中，即通过精准提高某些严重缺失的有益菌，来恢复患者肠道微生物群的正常结构，达到疾病治疗目的。例如，尼日尔和塞内加尔受恶性营养不良症夸希奥科病（Kwashiorkor）影响的人群，在宏基因组学筛选的基础上获得了潜在的Kwashiorkor微生物特征。另外，利用培养组学又鉴定出营养不良症个体缺失的45种细菌，并通过进一步实验，找到其中可用于细菌疗法的12株候选菌[23，25]。

五、肠道微生物群之间的相互作用研究

肠道微生物群不仅独立发挥作用，微生物群之间也存在着紧密的联动和协作。因此，如何揭示肠道细菌之间的互作关系，对探讨复杂的肠道生态系统至关重要。迄今为止，在肠道微生物群相互作用方面的研究仍相当有限。在早期，研究人员主要评价了双歧杆菌等益生菌株对其他肠道共生菌或病原体的抑制作用，此工作对体外研究肠道微生物群之间的营养互作具有非常好的借鉴意义。目前，肠道微生物群相互作用研究中涉及的菌株不超过100种，该数目仅占可培养肠道微生物总数的5%左右，与宏基因组学分析检测得到的肠道微生物数量相比更是微乎其微（约0.002%）。为减小肠道微生物群测序、菌株培养和细菌—细菌相互作用研究之间巨大的细菌数量差异，已有多种实验方法和研究体系正在构建，但面临的挑战是巨大的。肠道微生物群测序、菌株培养与细菌—细菌相互作用研究分别涉及的细菌数量统计如图2-3所示。

目前，研究人员构建的生物体外人工环境可提供简单、可控的体外系统来研究细菌—细菌之间的相互作用。虽然体外系统有许多缺点，如缺乏微生物群—宿主之间的相互作用；但该系统具有自动化、小型化和高通量的优点，可为体内实验提供相对可靠的预判，也可对体内的实验结果进行验证。在人类肠道微生物研究方面，已有数种可用于研究细菌—细菌或细菌—宿主相互作用的体外平台（见图2-4）[26]。此类系统从经典的分批发酵系统，到经过各种改良的多阶段连续培养系统，再到具有细菌—宿主互作功能模块（如将人源化细胞整合到标准微生物研究中）的微液滴培养系统，都为细菌—细菌和细菌—宿主的相互作用提供了良好的研究平台。

（1）分批发酵系统。

分批发酵系统是最常用的微生物体外培养模型，它是一个完全封闭的系统。该系统可控制环境条件，在培养前给予细菌充足的营养，还可在培养过程中调节发酵液的pH值，并逐渐添加细菌生长所需的关键营养素。分批发酵系统包括批次反应器、试管、孔板和微流控液滴（见图2-4）。在加入细菌菌株或菌株混合物后，该系统可通过平板计数法、光密度分析法和流式细胞术等方法实时监测细菌的总体情况或单个菌株的生长情况。在两株以上的混合菌培养体系中，以前的常规方法是采用不同的荧光标记物追踪单个菌株，但荧光标记物的数量有限，极大地限制了共培养的菌株总数。近年来，随着高通量基因测序技术的发展，分批发酵系统可结合定期采样、高通量扩增子或鸟枪测序的方法，突破共培养菌株的数量限制，大大拓宽了多菌株复杂培养体系在分批发酵系统中的应用[27]。虽然分批发酵的操作相对简单，系统构建方便，但该封闭系统对发酵过程中的稳态与否无法量化。

（2）连续培养系统。

与分批发酵系统不同，连续培养系统可保持培养基的流入和流出处于平衡状态，因此可将培养物维持在特定的生长速率和生理状态下。连续培养系统的应用实例包括化学恒温器和微型生物反应器阵列（见图2-4），该系统通过溢流装置将几个连续反应器依次进行物理耦合，并分别施加相同或不同的环境条件。连续培养系统可通过改变pH值、设置培养基的停留时间、添加酶和胆盐等特定成分等，来模拟胃、小肠和大肠等不同部位的生理状况[28]。然而，连续培养模型虽然可将肠道微生物群固定在凝胶微粒上进行培养，但仍难以重现在人类肠道中观察到的微生物群组成或微生物群落状态[28]，主要原因在于该系统虽然考虑了人体胃肠道的诸多动力学特性（如胃、肠排空时间），有的甚至增加了人源化细胞或细胞黏液包被的磁珠，但对宿主的功能模拟依然非常薄弱。尽管如此，连续培养系统仍是外源物质生物转化和营养保健品开发的首选筛选工具。

（3）微液滴培养系统。

微液滴培养系统是一种特殊的分批发酵系统，它采用一种廉价、高通量的方式来研究多种微生物间的相互作用。在过去，人们认为微液滴培养是一种可通过细菌—细菌相互作用来预测肠道内菌群动态的有效方法，然而，由于培养系统中大多数微液滴池的体积较小，采样次数将受到限制；而且与传统的发酵罐相比，它更难控制培养条件（如pH值和营养物的添加）。此外，虽然各微液滴池可通过串行传输的方式形成连续培养系统，但是尚不清楚此培养条件下的菌落动态是否会受到营养浓度波动的影响。随着微流体技术的进步，上述问题有望在更复杂的高通量分选系统中得到解决。

需要强调的是，在已开发的所有体外菌群培养系统中，尚没有可完全模拟肠道内微生物群落的培养体系。目前，肠道芯片模型、HuMiX系统和微型生物反应器等有望在不远的将来实现对肠道内环境的全真模拟[29，30]。模拟肠道环境的主要挑战在于细菌与宿主细胞之间的分层/分级相互作用，以及宿主肠道免疫系统的复杂性。将人源化细胞整合到高通量发酵系统中（如在分化的Caco-2肠细胞层上对细菌菌株进行负载培养）可部分实现宿主细胞对特定细菌的响应功能。