细胞破碎（cell rupture）是指通过物理、化学、酶或机械的方法破坏细胞壁或细胞膜，使胞内产物获得最大程度的释放，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。由于采用的表达系统不同或采用的DNA重组技术不同，目的蛋白表达的定位也不同（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外）。分泌到胞外的产物，不需破碎，其分离和纯化都相对简单。但许多生物活性物质结构复杂，如果分泌到培养液中其活性往往会改变，必须在细胞内组装来获得生物活性。因此在选择破碎方法时不仅考虑细胞破碎效果和产物释放率，还要考虑产物的稳定性和易于后期纯化及破碎的规模与成本。

细胞破碎目的是使胞内产物获得最大程度的释放。由于各种生物的细胞壁结构和组成不完全相同，因此细胞破碎的难易程度也不同。另外，不同的生化物质，其稳定也存在很大差异，在破碎过程中应防止其变性或被胞内酶水解。因此选用适宜的破碎设备和破碎方法，对后期的纯化起很大作用。常用细胞破碎方法见表4-8。

机械破碎主要靠挤压、剪切和撞击作用，具有处理量大、破碎效率高、速度快等优点，是工业规模细胞破碎的主要手段。常用机械破碎方法主要包括高压匀浆法、珠磨法和超声波破碎法等方法。

高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵和排出阀组成。物料在柱塞作用下通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的特定宽度的限流缝隙中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，产生空穴效应、撞击效应和剪切效应等多种作用，把原先比较粗糙的乳状液或悬浮液加工成极细微分散、均匀、稳定的液-液乳化物或液-固分散物（图4-3）。

高压匀浆破碎细胞影响因素有操作压力、悬浮液的黏度、料液温度。在一定范围内，提高压力可增加破碎率，减少操作次数。但压力过高，温度难以控制。一般压力每上升10MPa，温度上升2℃。因此在操作方式上，一般采用在一定压力下多次循环通过等方式连续操作。为了控制温度的升高，可外置冷却循环装置调节温度，使出口温度调节在20℃左右。一般大肠埃希菌破碎在压力为80MPa条件下循环两次，细胞即可完全破碎；酵母一般在100MPa条件下循环两次，破碎率达到95%以上。高压匀浆法适用于酵母、大肠埃希菌、巨大芽胞杆菌和黑曲霉等，但较易造成堵塞的团状或丝状真菌、较小的革兰阳性菌以及有些质地坚硬的亚细胞器易损伤匀浆阀，不适合用该法处理。

高速珠磨机的破碎腔由夹套组成，夹套内通冷却剂可以移出细胞破碎时产生的热量。破碎腔内装有直径极细的无铅玻璃珠、石英砂、氧化锆或其他材质的微珠。当启动电机后，玻璃珠随搅拌桨转动而进行各种形式的运动。由于球体之间以及球体与罐壁之间的摩擦作用，使得球体随罐壁转动上升到一定高度后以抛物线方式往下落，从而珠子与细胞之间产生了撞击和剪切效应，使细胞破碎，释放出内含物。在细胞匀浆液出口处设置了珠液分离器滞留珠子，使珠液分离，破碎能够连续进行（图4-4）。

珠磨法操作的有效能量利用率仅为1%左右，破碎过程产生大量的热能，因此必须要选用夹套冷却装置，降低物料的温度。一般破碎细胞操作方法分为间歇和连续操作，适用于绝大多细菌、真菌菌丝和藻类等微生物细胞的破碎。与高压匀浆法相比，影响破碎率的操作参数较多，如搅拌速度、料液的循环速度、细胞悬浮液的浓度、珠粒大小和数量及温度等，操作过程的优化设计较复杂。一般破碎细菌多采用0.1mm的玻璃珠；破碎酵母、藻类和组织培养细胞用0.5mm的玻璃珠；动植物的组织用1mm的玻璃珠。

超声波破碎细胞的原理是将电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质（如水）而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生空化效应，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，从而起到破碎细胞等物质的作用。超声波通常在15～25kHz的频率下操作，具有频率高、波长短、定向传播等特点，但该方法由于处理量小、产热高、时间长、噪声大及超声波产生的化学自由基团能使一些敏感性活性物质变性失活，一般仅限于实验室规模。

超声波破碎细胞受多种因素的影响，如：超声探头的形状和材料、声频、声能、体积、破碎时间、细胞黏度等因素。此外介质的离子强度、pH和细胞类型也有很大影响。如杆菌比球菌易破碎，革兰阴性菌比阳性菌易破碎，而酵母的破碎效果较差。一般超声操作在冰浴下进行短时破碎，细胞浓度应低于20%，一般破碎1～2分钟，冷却1～2分钟以上。超声破碎所需时间根据产物而不同，有些仅需每次1分钟，2～3次，而一些细胞破碎需10次以上。超声波破碎也可与其他方法结合使用，如冻融方法，可节省超声波破碎的时间。

包括物理法（干燥法、反复冻融法、渗透压冲击法）、化学法、酶溶法等，其中化学法和酶溶法应用最为广泛。

主要原理是使细胞结合水分丧失，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用有机溶剂如丙酮、丁醇或缓冲溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。干燥法可分为空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。酵母常在空气中干燥（25～30℃），再用其他溶剂抽提；细菌适用于真空干燥，把干燥成块的菌体磨碎再进行抽提；冷冻干燥适用于制备不稳定的生化物质，在冷冻条件下磨成粉，再用缓冲液抽提。干燥法条件变化剧烈，易引起蛋白质或其他组分变性，应用受到限制。

主要原理是在冷冻条件下促使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面冷冻时胞内水结晶，胞内冰晶引起细胞膨胀破裂。一般操作是将细胞急剧冻结至-20～-15℃，使之凝固，然后在室温缓慢融化，此冻结-融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。该法较温和，但需要反复冻融，周期长且破碎率较低，仅适用于细胞壁较脆弱的菌体。在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性，不适合对冷冻敏感的目的产物。

主要原理是由于渗透压剧烈改变，使细胞快速膨胀破裂。一般操作过程中首先将细胞放在高渗透压的介质如一定浓度的甘油或蔗糖溶液，使之脱水收缩，当达到平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中，由于渗透压的突然变化，细胞外水分迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂，它的内含物随即释放到溶液中。该法细胞破碎率低，仅适用于不具有细胞壁或细胞壁较脆弱的细胞，不适用于革兰阳性菌。

是使用某些化学试剂如酸碱、有机溶剂、变性剂、表面活性剂、金属螯合剂等，改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来。化学法对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内，碎片少，浆液黏度低，易于固液分离和进一步提取。但有些试剂有毒，且易引起活性物质的失活变性。

用碱处理可溶解除去细胞壁以外的大部分组分，酸处理可使蛋白质水解成游离氨基酸。酸碱还可以调节溶液的pH，改变蛋白质的电荷特性，提高产物的溶解度，便于后面的提取。

分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。如丙醇、丁醇、三氯甲烷等。但有机溶剂易引起蛋白质变性失活，使用时应考虑其稳定性，操作时应在低温下进行。

通过变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。常用变性剂有盐酸胍和脲。

可促使细胞某些组分溶解，改变膜的通透性，其增溶作用有助于细胞的破碎。常用的表面活性剂有曲拉通 X-100、十二烷基磺酸钠、吐温40、吐温80等。

用EDTA处理革兰阴性菌，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴，对细胞外层膜有破坏作用。

是利用酶反应分解、破坏细胞壁上的特殊化学键以达到破壁的目的。即利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步提高其对胞内产物的通透性。该法操作温和，选择性强，酶能快速地破坏细胞壁，而不影响细胞内含物的质量，但酶的费用高，通用性差，因而限制了它在大规模生产中的应用。常用的溶酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等。一般细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。

自溶作用是酶法的另一种方式，它是利用微生物自身产生酶来溶菌，而非外加其他酶。通过调节温度、时间、pH、激活剂和细胞代谢途径等诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。

细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：

式（4-1）中， Y（%）为细胞破碎率； N ₀为原始细胞数量； N为经 t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。

破碎率的检测对于细胞破碎效果的评估、破碎工艺的选择、工艺放大和工艺条件的优化起非常重要的作用。常用的检测细胞破碎程度的方法有直接计数法、间接计数法和测定电导率法等。

一般采用涂片染色的方法，将完整细胞与破碎细胞区分开来，通过显微镜或电子微粒计数器直接计数破碎前后完整细胞的数量。如采用革兰染色方法，完整的酵母细胞呈紫色，受损的酵母细胞呈亮红色，加以区别。

间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液离心上清中蛋白质含量或特定酶的活力，直接与100%破碎时的标准值比较，间接计算出细胞的破碎率。另外也可以用离心细胞破碎液观察沉淀模型的方法，即完整的细胞壁比细胞碎片先沉淀下来，并显示不同的颜色和纹理。对比两项，可间接计算细胞破碎率。

当细胞内含物释放到缓冲液中时，电导率将发生变化且电导率与细胞破碎率呈线性关系，即随电导率的增加破碎率相应增加。但因该法受到多种因素影响，因此应预先用其他方法来标准化。