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三、不同表达系统中影响发酵（培养）的主要因素及控制
目前基因重组蛋白的表达系统主要分为大肠埃希菌表达系统、酵母表达系统、哺乳动物表达系统、昆虫表达系统、转基因动物表达系统及转基因植物表达系统。各表达系统的优缺点如表4-4所示。
表4-4 不同表达系统优缺点
这里主要针对基因重组蛋白中常用的微生物表达系统、哺乳动物细胞表达系统的发酵（培养）主要因素及控制进行概述。
(一)微生物表达系统 1.培养方法
基因工程菌常用的培养方式有分批发酵（batch fermentation）、补料分批发酵（fed-batch fermentation）、连续发酵（continuous fermentation）、透析培养、固定化培养等。
分批发酵是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入工程菌种进行培养，使其生长繁殖和产物合成。除了不断进行通气（好氧发酵）和为调节发酵液的pH而加入酸碱溶液外，与外界没有其他物料交换的一种发酵方式。其优点是工艺操作简单，比较容易解决杂菌污染等问题；缺点是菌体产量及表达量相对低，生产周期长，设备有效利用率低，生产成本高。
补料分批培养是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，又称半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基或某些营养物质，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，是目前应用最广泛的发酵技术，是实现高密度培养的关键要素。补料方式分为非反馈补料（包括恒速补料、变速补料、指数补料）和反馈补料（包括恒溶氧法、恒pH法、菌体浓度反馈法、CERT法、DO-stat法）。和传统的分批发酵相比，补料分批发酵可以降低底物对工程菌生长及产物合成的抑制，有效提高产量及表达量，染菌和退化的概率小，保持质粒稳定性，设备有效利用率高，降低生产成本，并对发酵过程可实现优化控制。
连续培养又叫开放培养，是指菌体培养达到一定浓度后，以一定的流速向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，以控制一定稀释率，进行不间断培养的发酵过程。其优点可为工程菌提供恒定的生长环境，控制其比生长速率、产物稳定，设备利用率高；缺点是较分批发酵营养成分利用率和产物浓度较低，染菌概率和质粒不稳定增大并对设备要求较高。
透析培养是利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。采用膜透析装置在发酵过程中用蠕动泵将发酵液打入罐外的膜透析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环。用这种方法培养，微生物可不断地受到新营养的补给，同时也不断地排出代谢副产物如醋酸等，因此可以延长对数期的增殖，获得高密度菌体。膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液组成，循环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间等都对产物的产率有影响。该方法的优点是解决了传统发酵过程中，由于醋酸等代谢副产物的积累影响菌体的生长和外源基因的表达。
固定化培养就是将被培养生物体固定在一定的培养基上进行培养的过程。基因工程菌经固定化培养后，解决了质粒的稳定性问题，便于进行连续培养，特别对分泌型菌更为有利。
2.影响因素 （1）温度对发酵的影响及控制：
在影响微生物生长繁殖的各种物理因素中，温度是最重要因素之一。由于微生物的生长繁殖和产物的合成都是在各种酶的催化下进行的，而温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵过程中必须保证稳定而又合适的温度环境。温度对发酵的影响是多方面的，对微生物细胞的生长和代谢、产物合成的影响是各种因素综合表现的结果。
1）温度对微生物细胞生长的影响：
大多数微生物适宜在20～40℃的温度范围内生长，嗜冷菌在温度低于20℃生长速率最大，嗜中温菌在30～35℃生长，嗜热菌在50℃以上生长。在最适宜的温度范围内，微生物的生长速率可以达到最大，当温度超过最适生长温度，生长速率随温度的增加或降低而下降。
温度对细胞生长的影响是多方面的。一方面在其最适温度范围内，生长速率随温度的升高而增加，一般当温度增加10℃，生长速率大致增长1倍。这是由于生长代谢以及繁殖都是酶促反应，根据酶促反应的动力学来看，温度升高，反应速度加快，呼吸强度加强，必然最终导致细胞生长繁殖加快。当温度超过最适生长温度，生长速率将随温度的增加而迅速下降。高温会使微生物细胞内的蛋白质发生变性或者凝固，同时破坏微生物细胞内的酶活性，从而杀死微生物。温度越高，微生物的死亡就越快。微生物的种类不同，所具有的酶系及其性质不同，生长所要求的温度也不同。即使同一种微生物，由于培养条件的不同，其最适的温度也有所不同。另一方面，不同生长阶段的微生物对温度的反应不同，处于迟滞期的细菌对温度最敏感。将其置于最适生长温度，可以大大缩短迟滞期，反之会增加发酵时间。对于对数生长期的细菌，即使在发酵过程中升温，对其破坏作用也较弱。因此一般在发酵过程中，在最适温度范围内提高对数生长期的温度，即加快菌体生长，又避免了热作用的破坏。
2）温度对发酵产物的影响：
温度除了影响发酵过程中菌体生长和产物形成外，还通过影响基质和氧在发酵液中的溶解速度和传递速率，影响菌对某些基质的分解吸收速度，使生物合成途径发生改变。如在某些重组工程菌的表达过程中，在较低温度下以可溶或大部分为可溶的形式表达目的蛋白，而在较高温度下易形成包含体。
3）温度的控制：
最适温度的选择：最适发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。但最适生长温度与最适生产温度往往是不一致的。各种微生物在一定条件下，都有一个最适的温度范围。微生物种类不同，所具有的酶系不同，所要求的温度不同。同一微生物，培养条件不同，最适温度不同。
最适发酵温度随着菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。理论上，整个发酵过程中不应只选一个培养温度，而应根据发酵不同阶段，选择不同的培养温度。在生长阶段，应选择最适生长温度；在产物生成阶段，应选择最适生产温度。发酵温度可根据不同菌种、不同产品进行控制。但在工业发酵中，由于发酵液的体积很大，升降温度都比较困难，所以在整个发酵过程中，往往采用一个比较适合的恒定培养温度，使得到的产物产量最高，或者在可能条件下进行变温发酵。
温度的控制：在发酵过程中随着微生物对营养物质的利用，以及机械搅拌的作用，将产生一定的热能。同时因为罐壁散热、水分蒸发等也会带走部分热量。在发酵过程中，引起温度变化的原因是由于发酵过程中所产生的净热量，称为发酵热（Q 发酵）。它包括生物热、搅拌热、蒸发热、通气热、辐射热和显热等。因此，要维持一定的发酵温度，必须采取保温措施，利用自动控制或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇形管中，通过热交换来降温，保持恒温发酵。如果气温较高，作为冷却水的地表水温度又高于所控制的温度，致使冷却效果差，达不到预定的温度，须采用冷冻盐水进行循环式降温，以迅速降到最适发酵温度。因此大工厂需要建立冷冻站，提高冷却能力，以保证发酵在最适温度下进行。
（2）pH对发酵的影响及其控制：
pH是影响微生物生长和产物合成最重要的因素之一，是代谢活动的综合指标。不同种类的微生物对pH的要求不同。大多数细菌最适pH为6.5～7.5，真菌一般为4.0～5.8，酵母为3.8～6.0，放线菌为6.5～8.0。控制适宜的pH不仅能保证微生物正常生长与产物的合成，还是防止杂菌污染的有效措施。
1）pH对发酵的影响：
发酵培养基的pH对微生物生长具有非常明显的影响，也是影响发酵过程中各种酶活性的重要因素。pH对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面：影响酶的活性，当pH抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分的解离，进而影响微生物对这些成分的吸收；pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。
培养基中营养物质的代谢是引起pH变化的主要原因，发酵液pH的变化是菌体代谢的综合效果。由于pH不当，可能严重影响菌体的生长和产物的合成，因此对微生物发酵来说有各自的最适生长pH和最适生产pH。各种不同的微生物，对pH的要求不同。在微生物的生长过程和产物的合成过程的最适pH也可能有所不同。多数微生物生长都有最适pH范围及其变化的上下限：上限都在8.5左右，超过此上限，微生物将无法忍受而自溶；下限以酵母为最低（2.5），但菌体内的pH一般认为是中性附近。pH对产物的合成有明显的影响，因为菌体生长和产物合成都是酶反应的结果，仅仅是酶的种类不同而已，因此代谢产物的合成也有自己最适的pH范围。另外，pH还会影响某些菌的形态。
2）发酵过程pH的变化：
在发酵过程中，pH往往处于动态变化中。pH的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。在产生菌的代谢过程中，菌体本身具有一定的调整周围环境pH、构建最适pH的能力。但外界条件发生较大变化时，pH将会不断波动。一方面，微生物通过代谢活动分泌有机酸如乳酸、醋酸、枸橼酸等或一些碱性物质，导致发酵环境的pH变化；另一方面，微生物通过利用发酵培养基中的酸性物质或碱性物质，导致发酵环境的pH变化。
培养基中的营养物质的代谢也是引起pH变化的重要原因。微生物生长或合成产物过程中消耗碳源释放二氧化碳，pH降低；消耗蛋白质或其他含氮有机物释放氨，pH上升。发酵所用的碳源种类不同，pH变化也不一样。发酵液的pH变化是菌体代谢反应的综合结果。从代谢曲线的pH变化就可以推测发酵罐中的各种生化反应的进展和pH变化异常的可能原因。在发酵过程中，要选择好发酵培养基的成分及其配比，并控制好发酵工艺条件，才能保证pH不会产生明显的波动，维持在最佳的范围内，得到良好的结果。实践证明，维持稳定的pH，对产物的形成有利。
3）发酵pH的确定和控制：
发酵pH的确定：微生物发酵的最适pH范围一般是在5～8之间，但发酵的pH又随菌种和产品不同而不同。由于发酵是多酶复合反应系统，各酶的最适pH也不相同，因此，同一菌种，生长最适pH可能与产物合成的最适pH是不一样的。因此，应该按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH范围，使产物的产量达到最大。
最适pH是根据试验结果来确定的。将发酵培养基调节成不同的出发pH进行发酵，在发酵过程中，定时测定和调节pH以维持出发pH，或者利用缓冲液配制培养基来维持。定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的pH为菌体生长的最适pH。以同样的方法，可测得产物合成的最适pH。但同一产物的最适pH，还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。在确定发酵最适pH时，要不定期考虑培养温度的影响，若温度提高或降低，最适pH也可能发生变动。
pH的控制：发酵过程中为稳定保持最适pH，首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的pH变化在合适的范围内。在培养基的组成中加入一定量的碳酸钙或磷酸盐，形成缓冲溶液调节发酵过程中的pH变化；还可以在培养基中加入一定量的生理酸性或生理碱性化合物，中和代谢过程中产生的酸或碱，以维持一定pH。利用上述方法调节pH的能力是有限的，如果达不到要求，可以在发酵过程中直接补加酸、碱或补料的方式来控制，特别是补料的方法，效果比较明显。过去是直接加入酸（如HCl）或碱（如NaOH）来控制，但现在常用的是以碳源（如葡萄糖）和碱性物质（如氨水、尿素）来控制。它们不仅可以调节pH，还可以补充碳源或氮源。当发酵的pH降低时，补加氨水，就可达到调节pH和补充氨氮的目的；反之，pH升高，就补加碳源。
目前，常采用补料的方法来调节pH，这种方法既可以达到稳定pH的目的，又可以不断补充营养物质，解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。也就是说，采用补料的方法，可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH和培养液的特性（如菌浓等）等几个目的。
（3）溶解氧对发酵的影响及其控制：
好气性生物的生长发育和产物的合成都需要消耗氧气，它们只有在氧分子存在的情况下才能完成生物氧化作用。菌群在大量扩增过程中，进行耗氧的氧化分解代谢，发酵过程中随溶解氧浓度的下降，细胞生长减慢；外源基因的高效转录和翻译需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。因此维持较高水平的溶解氧浓度，才能提高菌的生长及外源蛋白产物的合成。一般在生长过程中溶解氧浓度≥40%，产物合成过程中解氧浓度≥30%。
1）溶解氧对发酵的影响：
在 25℃、0.10MPa下，空气中的氧在水中的溶解度为0.25mmol/L，在发酵液中的溶解度只有0.22mmol/L，而发酵液中的大量微生物耗氧迅速，耗氧速率大于25～100mmol/（L·h）。因此，供氧对于好氧微生物来说是非常重要。在好氧发酵中，微生物对氧有一个最低要求，满足微生物呼吸的最低氧浓度叫临界溶氧浓度（critical value of dissolved oxygen concentration），用c临界表示。在c临界以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降。当不存在其他限制性基质时，溶解氧高于c临界，细胞的比耗氧速率保持恒定；如果溶解氧低于c临界，细胞的比耗氧速率就会大大下降，细胞处于半厌氧状态，代谢活动受到阻碍。培养液中维持微生物呼吸和代谢所需的氧保持供氧与耗氧的平衡，才能满足微生物对氧的利用。
在发酵过程中，影响溶解氧的因素有以下几方面：
培养基的成分和菌浓显著影响耗氧。培养液营养丰富，菌体生长快，耗氧量大；菌浓高，耗氧量大；发酵过程补料或补糖，微生物对氧的摄取量随之增大。
菌龄影响耗氧。对数生长期呼吸旺盛，耗氧量大；发酵后期菌体处于衰老状态，耗氧量自然减弱。
发酵条件影响耗氧。在最适条件下发酵，耗氧量大；发酵过程中，排出有毒代谢产物如二氧化碳、挥发性的有机酸和过量的氨，也有利于提高菌体的摄氧量。
2）供氧与微生物呼吸代谢的关系：
好氧微生物生长和代谢均需要氧气，因此供氧必须满足微生物在不同阶段的需要。由于各种好氧微生物所含的氧化酶系（如过氧化氢酶、细胞色素氧化酶、黄素脱氢酶、多酚氧化酶等）的种类和数量不同，在不同的环境条件下，各种不同的微生物的吸氧量或呼吸强度是不同的。微生物的吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率两种方法来表示。呼吸强度又称氧比消耗速率，是指单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧量，单位为mmol O 2/（g干菌体·h）。耗氧速率又称摄氧率，是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，单位为mmol O 2/（L·h）。呼吸强度可以表示微生物的相对吸氧量，但是，当培养液中有固体成分存在时，测定起来有困难，这时可用耗氧速率来表示。微生物在发酵过程中的耗氧速率取决于微生物的呼吸强度和单位体积菌体浓度。
在发酵生产中，供氧的多少应根据不同的菌种、发酵条件和发酵阶段等具体情况决定。在菌体生长期，供氧必须满足菌体呼吸的需氧量，若菌体的需氧量得不到满足，则菌体呼吸受到抑制，从而抑制菌体生长，引起乳酸等副产物的积累，菌体收率降低。但是供氧并非越大越好，当供氧满足菌体需要，菌体的生长速率达最大值，如果再提高供氧，不但不能促进菌体生长，造成能源浪费，而且高氧水平会抑制菌体生长。
3）发酵过程溶解氧的变化：
在发酵过程中，在已有设备和正常发酵条件下，每种产物发酵的溶解氧变化都有自己的规律。一般在发酵的延滞期，菌体繁殖速率缓慢，氧消耗量较低。在对数生长期菌群大量繁殖，需氧量不断增加，此时的需氧量超过供氧量，使溶解氧明显下降，出现一个低峰，工程菌的摄氧率同时出现一个高峰，发酵液中的菌浓也不断上升，黏度一般在这个时期也会出现一高峰阶段。发酵中后期，对于分批发酵来说，溶解氧变化比较小。进入稳定期，因为菌体已繁殖到一定浓度，呼吸强度变化也不大，如不补加基质，发酵液的摄氧率变化也不大，供氧能力仍保持不变，溶解氧变化也不大。但当外界进行补料（包括碳源、前体、消泡剂），则溶解氧就会发生改变，变化的大小和持续时间的长短，则随补料时的菌龄、补入物质的种类和剂量不同而不同。如补加糖后，发酵液的摄氧率就会增加，引起溶解氧下降，经过一段时间后又逐步回升；如继续补糖，甚至降至c临界以下，而成为生产的限制因素。在生产后期，由于菌体衰老，呼吸强度减弱，溶解氧也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶解氧更会明显上升。
在发酵过程中，有时出现溶解氧明显降低或明显升高的异常变化。常见的是溶解氧异常下降，排除设备自身原因外，可能有下列几种原因：污染好气性杂菌，大量的溶解氧被消耗掉，可能使溶解氧在较短时间内下降到零附近，如果杂菌本身耗氧能力不强，溶解氧变化就可能不明显；菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶解氧下降；工艺控制发生变化，也可能引起溶解氧下降，如碳源补加过多或消泡剂加量太多等。引起溶解氧异常升高的原因，在供氧条件没有发生变化的情况下，主要是耗氧出现改变，如菌体代谢出现异常，耗氧能力下降，使溶解氧上升。特别是污染烈性噬菌体，影响最为明显，产生菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶解氧有可能上升，直到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶解氧就直线上升。
由上可知，从发酵液中的溶解氧变化，就可以了解微生物生长代谢是否正常，工艺控制是否合理，设备供氧能力是否充足等问题，帮助我们查找发酵不正常的原因和控制好发酵生产。
发酵液的溶解氧浓度，是由供氧和需氧两方面所决定的。也就是说，当发酵的供氧量大于需氧量，溶解氧就上升，直到饱和；反之就下降。因此要控制好发酵液中的溶解氧，需从这两方面着手。
在供氧方面，主要是设法提高氧传递的推动力和液相体积氧传递系数 K L a值。结合生产实际，在可能的条件下，采取适当的措施来提高溶解氧，如调节搅拌转速或通气速率来控制供氧。但供氧量的大小还必须与需氧量相协调，也就是说，要有适当的工艺条件来控制需氧量，使产生菌的生长和产物生成对氧的需求量不超过设备的供氧能力，使产生菌发挥出最大的生产能力。这对生产实际具有重要的意义。
发酵液的需氧量，受菌浓、基质的种类和浓度以及培养条件等因素的影响，其中以菌浓的影响最为明显。发酵液的摄氧速率OUR是随菌浓增加而按比例增加，但传氧速率OTR是随菌浓的对数关系减少，因此可以控制菌的比生长速率比临界比生长速率μ临略高一点的水平，达到最适菌浓，菌体的生产率最高。这是控制最适溶解氧浓度的重要方法。最适菌浓既能保证产物的比生产速率维持在最大值，又不会使需氧大于供氧。控制最适的菌浓可以通过控制基质的浓度来实现。如通过控制补加葡萄糖的速率达到最适菌浓，利用溶解氧的变化来自动控制补糖速率，间接控制供氧速率和pH，实现菌体生长、溶氧和pH三位一体的控制体系。
除控制补料速度外，在工业上，还可采用调节温度（降低培养温度可提高溶氧浓度）、增加罐压、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂等工艺措施，来改善溶解氧水平。
（4）基质的影响及其控制：
基质即培养微生物的营养物质也称为底物，主要包括碳源、氮源、无机盐等。对于发酵控制来说，基质是生产菌代谢的物质基础，既涉及菌体的生长繁殖，又涉及产物的形成。因此基质的种类和浓度与发酵代谢有着密切的关系。所以选择适当的基质和控制适当的浓度，是提高代谢产物产量的重要方法。就产物的形成来说，培养基过于丰富，有时会使菌体生长过旺，黏度增大，传质差，菌体不得不花费较多的能量来维持其生存环境，即用于非生产的能量大量增加。所以，在分批发酵中，控制合适的基质浓度不但对菌体的生长有利，对产物的形成也有益处。
1）碳源对发酵的影响及其控制：
常用的碳源有葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、糖蜜等。使用不同的碳源对菌体生长和外源基因的表达有较大影响。葡萄糖为速效碳源，易被菌体消耗，生长速率快，但所产生的副产物较多（如醋酸），影响菌体的生长和表达；以甘油为碳源时，生长速率缓慢，发酵周期延长，但它的代谢途径与葡萄糖不同，不产生醋酸等影响生长与表达的副产物，因此更易达到高密度培养。目前在发酵生产中常称使用葡萄糖作为碳源，它对Lac启动子有阻遏作用，因此通常降低葡萄糖在底物中的浓度（一般≤10g/L），采用流加的方式加入，以减少或消除对Lac启动子的阻遏作用。对Lac启动子来说，使用乳糖作为碳源，既可以提供能量，还可以起到诱导作用。因此选择最适碳源对提高代谢产物产量是很重要的。
碳源的浓度也有明显的影响。由于营养过于丰富所引起的菌体异常繁殖，对菌体的代谢、产物的合成及氧的传递都会产生不良的影响。若产生阻遏作用的碳源（葡萄糖）用量过大，则产物的合成会受到明显的抑制；反之，菌体生长和产物合成就都停止。所以控制合适的碳源浓度非常重要。控制碳源的浓度，可采用经验法和动力学法，即在发酵过程中采用中间补料的方法来控制。这要根据不同代谢类型来确定补糖时间、补糖量和补糖方式。动力学方法是要根据菌体的比生长速率、糖比消耗速率及产物的比生成速率等动力学参数来控制。
2）氮源对发酵的影响及其控制：
氮源有无机氮源和有机氮源两类。常用的有蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等。它们对菌体代谢都能产生明显的影响，不同的种类和不同的浓度都能影响产物合成的方向和产量。例如有些氮源容易被菌体所利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，特别是某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量。因此也要选择适当的氮源和浓度。
发酵培养基一般是选用含有快速利用和慢速利用的混合氮源，除了基础培养基中的氮源外，还要在发酵过程中补加氮源来控制其浓度。如根据产生菌的代谢情况，可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源，如酵母粉、玉米浆、尿素等；补加无机氮源氨水或硫酸铵是工业上的常用方法。氨水既可作为无机氮源，又可调节pH，以达到提高氮含量和调节pH的双重目的；还可补充其他无机氮源，但需根据发酵控制的要求来选择。
3）磷酸盐对发酵的影响及其控制：
磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产物所必需的。在发酵过程中，微生物摄取的磷一般以磷酸盐的形式存在。微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32～300mmol/L，但对次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol/L，提高到10mmol/L就明显地抑制其合成。因此控制磷酸盐浓度对微生物次级代谢产物发酵来说是非常重要的。磷酸盐浓度调节代谢产物合成机制，对于初级代谢产物合成的影响，往往是通过促进菌体生长而间接产生的，对于次级代谢产物来说，机制就比较复杂。
磷酸盐浓度的控制，一般是在基础培养基中采用适当的浓度。对于初级代谢来说，要求不如次级代谢那么严格。磷酸盐的最适浓度取决于菌种特性、培养条件、培养基组成和原料来源等因素，并结合具体条件和使用的原材料进行试验来确定。培养基中的磷含量还可能因为配制方法和灭菌条件不同而有所变化。在发酵过程中，若发现代谢缓慢，耗糖量低，可适当补充磷酸盐。
4）无机盐与微量元素：
无机盐和微量元素是指除碳、氮元素外其他各种重要元素及其供体。其中凡是微生物生长所需浓度在10 -4～10 -3mol/L范围内的元素，可称之为大量元素，主要是P、S、K、Mg、Ca、Na和Fe等；凡微生物生长所需浓度在10 -8～10 -6mol/L范围内的元素，可称之为微量元素，主要是Cu、Zn、Mn、Mo和Co等。这只是一个大致的划分，不同的微生物还是存在着一定的差别。无机盐的用量虽然不如碳源、氮源的用量大，但是对于微生物却有极其重要的生理作用，如构成菌体成分，作为酶的组成部分或者其激活剂、抑制剂，调节渗透压、菌体内部pH以及氧化还原电位等。无机盐尤其是微量元素在低浓度时对微生物的生长和产物的合成一般有促进作用，但是在高浓度时常表现为明显的抑制作用，有时甚至是毒性作用。而各种不同的微生物及同种微生物在不同的生长阶段对这些物质的最适浓度要求均不相同。因此，在生产中要通过试验预先了解菌体对无机盐和微量元素的最适宜的需求量，以稳定或提高产量。
无机元素（除氮、氧外）的来源和功能见表4-5。
表4-5 无机元素（除碳、氮外）的来源和功能
除上述主要基质外，还有其他培养基成分影响发酵。如促生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂及配制用水等。总之，发酵过程中，控制基质的种类及其用量是非常重要的，是发酵能否成功的关键。必须根据生产菌的特性和各个产物合成的要求，进行深入细致的研究，方能取得良好的结果。
（5）接种量的影响及其控制：
接种量是指移入发酵罐中的种子液的体积与培养液体积的比例。它的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量少，延长菌体的延滞期，不利于外源基因的生长与表达；接种量大，由于种子液中含有大量水解酶，有利于对底物的利用，缩短菌体的延滞期，并能使生产菌迅速占领整个培养环境，减少污染概率。但接种量过高又往往会使菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而抑制后期菌体的生长。所以接种量的大小取决于生产菌种在发酵中的生产繁殖速度，应通过试验进行确定。一般在外源蛋白的发酵过程中，接种量一般设计在5%～10%，可缩短延滞期，菌群迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。
（6）诱导时机的影响及其控制：
诱导剂的添加量及诱导时机都会影响到外源蛋白的表达水平。诱导时机的不同会影响到外源基因的表达以及工程菌的稳定性和活性。过早诱导会抑制细胞大量增殖，造成生物质和目的蛋白产量偏低，同时也增加了染菌的机会；而诱导过迟虽可获得高产量的生物质，但由于细胞生长停滞后，各种酶系统的活力下降，细胞表达外源蛋白的时间则减少，也会影响蛋白表达。选择诱导剂的添加浓度也非常重要。如诱导剂异丙基-β- D-2硫代半乳糖苷（IPTG）浓度过高，对含质粒工程菌的生长具有抑制作用，并有一定毒副作用，加之IPTG本身价格昂贵，会增加生产成本；诱导剂IPTG浓度过低，则会影响诱导效果，影响目的蛋白的表达量。确定诱导时机和诱导浓度，使得既能获得较高目的产物的表达量，又可获得较高的菌体重量，是高水平表达外源蛋白的培养中的重要问题。
Huazc等通过一系列试验提出可根据动力学模式来确定最佳的诱导时机。在这些动力学方程式中，细胞的生长、外源蛋白的产量、生物浓度以及比生长速率等参数都在考虑之列。试验结果显示诱导使携带质粒的细胞生长速度显著降低，而不带质粒的细胞则不受影响。因此提早诱导造成生物质和目的蛋白产量偏低，同时也增加了染菌的机会，而诱导较晚虽可获得高产量的生物质，但外源蛋白的表达量较低。在发酵生产中，一般外源蛋白在对数生长中后期进行诱导表达。
（7）补料控制的影响及其控制：
补料方式有很多种情况，有连续流加、不连续流加或多周期流加。每次流加又可分为快速流加、恒速流加、指数速率流加和变速流加。从补加培养基的成分来分，又可分为单组分补料和多组分补料。目前在发酵生产中常用补料分批发酵（fed-batch culture，简称FBC），同传统的分批发酵相比，FBC具有以下的优点：可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学的性质；可以使发酵过程最佳化，使菌种保持在最大生产力的状态，为自动控制和最优控制提供实验基础。同连续发酵相比，FBC不需要严格的无菌条件，产生菌也不会产生老化和变异等问题，适用范围也比连续发酵广泛。由于FBC有这些优点，现已被广泛地用于微生物发酵生产和研究中。
（8）泡沫对发酵的影响及其控制 1）泡沫的形成及其对发酵的影响：
在大多数微生物发酵过程中，由于培养基中有蛋白类表面活性剂（具有较高的表面张力）存在，在通气条件下，培养液中就形成了泡沫。泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系，气液之间被一层液膜隔开，彼此不相连通。形成的泡沫有两种类型：一种是发酵液液面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界限，如发酵前期的泡沫；另一种是发酵液中的泡沫，又称流态泡沫（fluid foam），分散在发酵液中，比较稳定，与液体之间无明显的界限。
发酵过程产生少量的泡沫是正常的。泡沫的多少一方面与发酵罐搅拌、通风有关；另一方面，与培养基性质有关。蛋白质原料如蛋白胨、玉米浆、黄豆粉、酵母粉等是主要的发泡剂，糊精含量多也引起泡沫的形成。发酵过程中，泡沫的形成有一定的规律性。当发酵感染杂菌和噬菌体时，泡沫异常多。
起泡会带来许多不利因素，如发酵罐的装料系数减少，液相体积氧传递系数减小等。泡沫过多时，影响更为严重，造成大量逃液，发酵液从排气管路或轴封逃出而增加染菌机会等，严重时通气搅拌也无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异常或菌体自溶。所以，控制泡沫是保证正常发酵的基本条件。
2）泡沫的控制：
泡沫的控制，可以采用三种途径：调整培养基中的成分（如少加或缓加易起泡的原材料）或改变某些物理化学参数（如pH、温度、通气和搅拌）或者改变发酵工艺（如采用分次投料）来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度。可采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫。还可以采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素。对于已形成的泡沫，工业上可以采用机械消泡和化学消泡剂消泡或两者同时使用。
机械消泡是一种物理消泡的方法，利用机械强烈振动或压力变化而使泡沫破裂。有罐内消泡和罐外消泡两种方法。前者是靠罐内消泡浆转动打碎泡沫；后者是将泡沫引到罐外，通过喷嘴的加速作用或利用离心力来消除泡沫。消泡剂消泡则是利用外界加入消泡剂，使泡沫破裂的方法。消泡剂都是表面活性剂，具有较低的表面张力，或者是降低泡沫液膜的机械强度，或者是降低液膜的表面黏度，或者兼有两者的作用，达到破裂泡沫的目的。常用的消泡剂主要有天然油脂类，高碳醇、脂肪酸和酯类，聚醚类及硅酮类等4大类。其中以天然油酯类和聚醚类在生物发酵中最为常用。在生产过程中，消泡的效果除了与消泡剂种类、性质、分子量大小、消泡剂亲油亲水基等密切相关外，还和消泡剂使用时加入方法、使用浓度、温度等有很大的关系。消泡剂的选择和实际使用还有许多问题，应结合生产实际加以注意和解决。
（9）发酵终点判断：
发酵类型不同，需要达到的目的也不同，对发酵终点的判断标准也有所不同。无论是初级代谢产物还是次级代谢产物，到了发酵末期，菌体的分泌能力都要下降，产物的生产能力也相应下降或停止，另外染菌概率也大大提高。
微生物发酵终点的判断，对提高产物的生产能力和经济效益十分重要。在工业化生产过程中，不能只单纯追求提高生产力，而不顾及产品的成本，必须将两者结合起来，既要有高产量，又要降低成本。
1）考虑经济因素：
发酵应以最低的综合成本来获得最大的生产能力的时间为最适发酵时间。在实际生产中，以缩短发酵周期，提高设备利用率，降低能耗，即使不是最高产量，但综合成本最低为最适宜放罐时机。
2）产品质量因素：
发酵时间长短对后续工艺和产品质量有很大影响。若发酵时间过短，产物的产量较低且过多未代谢营养物质残留在发酵液中，这些物质对下游分离纯化操作带来很大困难。但发酵时间过长，菌体会自溶，释放出菌体蛋白或体内水解酶，显著改变发酵液的性质，并会使一些不稳定的活性产物遭到破坏。所有这些都可能导致产物的产量及产物中的杂质含量增加，增加后续工段的难度。
3）特殊因素：
在个别发酵情况下，如染菌、代谢异常时，应根据不同情况进行适当处理，以免倒罐。合理的放罐时间是由试验来确定的，即根据不同的发酵时间所得到的产物量计算出发酵罐的生产能力和产品成本，确定生产力高而成本低的时间作为发酵终点。
(二)哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统因为蛋白合成、加工和分泌的信号能被动物细胞准确而有效地识别，能进行糖基化修饰，并适于表达完整的大分子蛋白，目前已广泛应用于生产具有重要医用价值的抗体、生长因子、疫苗及酶等生物制品，其市场份额已占世界生物高技术产品的50%。虽然其培养的原理与微生物基本相同，但哺乳动物细胞的培养成本高，培养条件苛刻，培养周期长，技术要求更高。
1.培养方法
哺乳动物细胞常用的培养方法有悬浮培养（suspension culture）、贴壁培养（anchorage-dependent culture）、贴壁悬浮培养（microcarrier culture）三种方式。
悬浮培养是指细胞在离体培养时不需要附着物，可以自由悬浮于培养基内生长增殖。它适用于非贴壁依赖性细胞株（如杂交瘤细胞），也适用于兼性贴壁细胞。该方法优点是操作简便，培养过程简单，传质和传氧较好，易扩大培养；该法的缺点是细胞培养密度低，转化细胞悬浮培养有潜在的致癌危险，培养病毒易失去病毒标记而降低免疫力，只有少数动物细胞适用于悬浮培养。此外，贴壁依赖性动物细胞不能进行悬浮培养。
贴壁培养是指大多数动物细胞在离体培养的条件下，都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体表面生长繁殖的培养方法。它适用于贴壁细胞（如Hela、Vero、CHO、BHK），也适用于兼性贴壁细胞。该方法的优点是适用细胞种类广，易实现高密度培养，细胞增殖速度快。但操作较麻烦，培养条件均一性差，需要合适的贴附材料和足够的表面积，传质和传氧较差，故放大培养受到一定限制。贴壁培养与悬浮培养主要不同之处是在传代或扩大培养时，需要用酶（如胰蛋白酶、依地酸二钠或胰蛋白酶-EDTA联用等）将细胞消化下来。
贴壁悬浮培养是结合贴壁培养和悬浮培养的，形成的一种理想的、更适用于工业化放大培养的新技术，目前已广泛应用于动物细胞的规模化生产中。
（1）微载体培养（microcarrier culture）：
是使细胞贴附于微小颗粒载体上，它可以创造相当大的贴附表面积，供细胞附着、延伸和增殖，充分发挥贴壁培养的优点；同时微载体体积小，比重轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的优点。
理想的微载体应具备以下条件：材料具有无毒害性、惰性，且表面性质与细胞具有良好的相容性，使其较好地附着、生长和增殖；微载体体积小，比重轻，可在低转速下悬浮，在静止时易沉降，便于换液和收获；微载体性质是软性的，避免在搅拌中由于相互摩擦而损伤细胞；具有良好的光学透明性，适用于在倒置显微镜下观察细胞在载体上的生长情况；粒径要均一，大小在60～250μm（溶胀后）为宜且应耐高压灭菌，可反复使用；原料来源充足，制作简便、廉价。常用的商品化的微载体如表4-6所示。
表4-6 常见动物细胞培养用商品化微载体
（2）包埋（entrapment）和微囊（microencapsulation）培养：
包埋培养是将细胞与高聚物或高聚物单体混合，随凝胶的形成，将细胞包埋进高聚物内部的网格中。此方法操作简单，条件温和，负荷量大，细胞泄露少，抗机械剪切力较强，但存在扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度且大分子基质不能渗透高聚物网格，往往有一些物质被排斥在外。一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常用载体为多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白。
微囊培养是在包埋培养技术上衍生而来的，是用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜，囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，微囊直径控制在200～400μm为宜。此方法可降低剪切力对细胞的影响，能够实现高密度培养，使产物浓度增加并有利于下游产物的纯化。但微囊制作复杂，成功率不高，微囊内死亡的细胞会污染正常产物；产物收集必须破壁，不能实现连续化生产。
2.培养方式
哺乳动物细胞的培养方式有分批式培养、流加式培养、半连续式培养、连续式培养和灌流式培养等。
分批式培养（batch culture）是指将细胞扩大培养后，一次性加入培养器内进行培养和扩增，在培养过程中其体积不变，不添加其他成分，至达到培养终点一次性收获细胞、产物培养基的一种方式。在培养器内的细胞经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期不同阶段。该方法操作简单，容易掌握，易放大，但不能使细胞处于最优培养条件，细胞产量及产物表达量相对低，设备有效利用率低。
流加式培养（feeding culture）是指先将一定量的培养液加入培养器中，接种细胞并进行培养，随细胞对营养物质的不断消耗，不断补加新鲜的营养物或培养基，使细胞进一步生长代谢，实现高密度培养，整个过程中没有流出和回收，直至培养终止时取出整个反应体系的方法。该法可以降低底物对细胞生长及产物合成的抑制，并可根据细胞生长情况进行调节，有效提高产量及表达量。但在动物细胞培养过程中，需要补加的营养成分较多，操作过程较为繁琐。流加的营养成分主要是葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸及维生素等。
半连续式培养（semi-continuous culture）是指在分批培养的基础上，每间隔一段时间取出部分培养物，再补充同等数量的新鲜培养液，剩余的培养物可作为种子继续培养，使反应器内的总体积保持不变的一种方法。该法操作简便，生产效率高，可反复收获产品，保持产物和细胞在较高的浓度水平，培养过程可延续很长时间，广泛应用于生产操作中。
连续式培养（continuous culture）是指将细胞种子接种到培养基中进行培养，在细胞达到最大密度之前，一方面以一定流速不断补加新鲜培养基，另一方面将含有细胞的培养物以相同的流速不断从反应器中取出，使细胞的培养条件处于一种恒定状态的方法，理论上该过程可以无限延续下去。该法可使细胞培养状态达到恒定，有效延长对数生长期，能够获得较高的细胞密度和产物浓度，设备利用率高，但由于开放式操作且培养周期长，易造成污染，对仪器设备及培养控制的技术要求高及在长期培养过程中细胞培养特性及分泌产物易变性。
灌流式培养（perfusion culture）是指将细胞接种到培养基内进行培养，在细胞增长和产物形成过程中不断将部分培养基取出，同时又连续灌注新的培养基的一种方法。它与其他培养方法不同之处是取出部分培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态的一种方法。细胞截流系统多采用微孔滤膜过滤、旋转膜系统或各种形式的沉降系统或透析系统。该法生产效率高，能够维持较高的细胞浓度，一般可达10 7～10 9/ml，大大提高产品的产量；同时可使细胞处于较好的营养状态，降低有害产物的积累；同时产物在罐内停留时间短，有利于保持产品的活性，也有助于减少培养细胞污染的机会，是目前新兴的较为先进的细胞培养方法。
3.影响因素
影响体外培养的哺乳动物细胞因素与微生物细胞大体相同，只是它对环境更加敏感。主要影响因素包括温度、pH、溶解氧、培养基的组成、渗透压、搅拌转数、葡萄糖、乳酸等。
（1）温度对细胞培养的影响及控制：
适宜的培养温度是体外培养细胞的必要条件，不同类型动物细胞的最适温度要求也不尽相同。一般哺乳类细胞体外培养的适宜温度是37℃；鸡细胞在30～42℃；昆虫类细胞在25～28℃；鱼类细胞在23～25℃。由于细胞的代谢强度与温度在一定范围内成正比，温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强，在低温下，虽影响细胞代谢，速度减缓，但并无伤害作用。而在高温条件下细胞会受到损伤甚至死亡，一般温度到43℃以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏、核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外使蛋白质变性。因此，动物细胞对温度波动敏感性强，较其他细胞培养对温度控制具有更严格要求，一般常采用铂电阻温度计来检测，灵敏度为±0.025℃，温度控制偏差在0.05℃范围内。
（2）pH对细胞培养的影响及控制：
pH影响细胞存活、生长及代谢，是哺乳动物细胞培养过程中关键性参数之一。大多数细胞生长的最适pH范围为7.2～7.4，有的细胞系生长最适pH略有不同，但其范围一般不超过6.8～7.6，过高或过低均不利于细胞生长，甚至导致死亡。极个别的细胞系如表皮细胞可在pH 5.5中维持存活。一般原代培养细胞对pH碱性的耐受比对酸性的耐受差，偏酸的环境比偏碱的环境对细胞生长有利。为了维持培养环境恒定的pH，通常采用CO 2、碳酸氢盐调节缓冲液的pH。磷酸缓冲液中的NaHCO 3可供给CO 2，但CO 2易于逸出，故只适用于封闭式培养。若开放式培养还需置于含有5%CO 2的气体环境中。还可以通羟乙基哌嗪乙烷磺酸缓冲液维持培养液的pH，它对细胞无毒性，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH。
（3）渗透压对细胞培养的影响及控制：
细胞在高渗透或低渗溶液中，可以发生皱缩或肿胀、破裂。所以，渗透压是体外细胞培养的重要条件之一。理想的渗透压因细胞的类型及种族而异，人血浆渗透压为290mmol/L，被视为是体外培养人类细胞的理想渗透压；哺乳动物细胞的渗透压一般为290～300mmol/L；人胚肺成纤维细胞为250～325mmol/L；鼠细胞则为310mmol/L左右。在实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适于大多数细胞。培养体系渗透压的维持主要与NaCl有关，但不能忽视其他电解质与渗透压的关系。为此，按一定比例控制培养基中离子平衡，这不仅是为了维持细胞张力，而且与细胞的代谢调节相关，直接影响细胞基本合成系统。
（4）溶解氧对细胞培养的影响及控制：
溶解氧不仅影响细胞的产率，而且直接或间接影响细胞的代谢，是体外培养细胞生存必需的条件之一。氧参加细胞的三羧酸循环，产生能量以供应给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。有些细胞在低氧条件下，可借糖酵解取得能量，但多数细胞低氧时不能生存。氧张力通常维持在略低于大气状态，若氧分压超过大气中氧的含量可能对有些细胞有害。不同类型的动物细胞所需最适溶解氧的水平不同，一般控制在20%～50%，可根据需要向培养液中加入空气、氧气、二氧化碳或氮气等控制溶解氧，还可以通过加大通气流量和适当提高转数等方法来进行溶解氧的调节。
（5）细胞接种密度对细胞培养的影响及控制：
在体外培养细胞中，适宜的接种密度，可以促使细胞增殖，接种密度太低或太高都不利于细胞的生长增殖。如果培养基与细胞的容积比例大于2000∶1，生长物质弥散到细胞外过多，将使细胞内浓度低于最小限度的浓度，此时细胞不能再增殖，培养基的pH变碱，抑制细胞生长，细胞变圆不能贴壁，甚至引起细胞死亡等。如果接种密度太高，每个细胞周围培养基的容积降至0.007mm 3以下，由于弥散率降低，细胞内生物质的浓度增加，容易使排出物或其他代谢产物达到饱和，能量来源也很快耗尽，因此也会妨碍细胞的增殖。细胞接种密度因不同细胞系而异，一般来说代谢旺盛、生长速度快的细胞（如肿瘤细胞），接种浓度宜偏低；而正常组织细胞生长较慢，代谢不够旺盛，接种浓度可偏高。
（6）搅拌转数对细胞培养的影响及控制：
当悬浮搅拌培养细胞时，搅拌速度既不能太快，也不能太慢。如果太慢，细胞易结团、下沉和贴壁，不利于细胞在悬浮状态下增殖；如果太快，容易起泡沫，细胞易窒息致死，同时，强烈的搅动易使细胞因机械损伤而破裂。所以选择适宜的搅拌速度很重要。一般哺乳动物细胞抗剪切力较差且各种细胞的适宜搅拌速度不一致，通常与细胞的特性和质量有关，应予以注意。
（7）基质的影响及其控制 1）氨基酸类：
氨基酸在细胞内有重要的生理作用，氨基酸浓度与细胞生长之间的平衡程度往往会影响细胞的存活和生长率。不同的细胞株自身生长和产物合成对氨基酸的需求不同，因此培养基配方不具有普适性。一般选择必需氨基酸（即体内不能合成但是体外细胞培养中的必需氨基酸如精氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸等）含量较高的培养基；其他非必需氨基酸即可以由细胞通过转氨作用自己合成，但是在培养基中添加适当浓度的氨基酸可以减轻细胞在合成方面的负担，提高谷氨酰胺及其他必需氨基酸的利用率，如天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸等。谷氨酰胺是多数细胞所需要的，是细胞的主要氮源，还可以作为细胞生长的能源物质和嘌呤、嘧啶核苷酸的前体，也可以直接作为细胞生长和产物合成中蛋白质和多肽的组成成分。因此，一般培养基中谷氨酰胺的浓度会大大高于其他氨基酸。
2）维生素类：
维生素一般作为辅酶或辅基参与细胞代谢的调控，虽然用量甚微，但却必不可少，没有它们的参与，细胞代谢就无法进行。一般维生素多来源于血清，但减少血清用量或采用无血清培养基时，需要在培养基中添加维生素。在细胞培养中起到重要作用的维生素有B族维生素（B 1、B 2、烟酸、生物素、泛酸、叶酸、B 12等）、维生素C、维生素A、维生素E等。不同配方的培养基中维生素的浓度有较大差异，这可能与不同细胞株对维生素耐受性差异相关。
3）无机盐类：
无机盐是细胞维持生命活动所不可缺少的营养成分，也是调节培养液渗透压及酸碱平衡的主要成分，并参与多种重要的生理活动。主要盐类包括Na ＋、K ＋、Ca 2＋、Mg 2＋、Cl -、 
、 
、 
等，还包括微量元素，它对于细胞生长代谢和产物合成都有促进作用，如铁、锰、铜、锌、钴、镍、铬、碘、硒、钼等。
、 、 等，还包括微量元素，它对于细胞生长代谢和产物合成都有促进作用，如铁、锰、铜、锌、钴、镍、铬、碘、硒、钼等。
4）葡萄糖：
葡萄糖是细胞的主要碳源和能量来源。在葡萄糖浓度高时，细胞更趋于进行糖酵解作用，大量葡萄糖不完全氧化生成乳酸；在葡萄糖水平低时，主要由钠离子推动的高亲和性转运过程摄取葡萄糖，细胞更趋于进行三羧酸循环，葡萄糖完全氧化生成二氧化碳。
5）其他成分：
胰岛素、转铁蛋白和牛血清白蛋白是无血清培养中常用的蛋白添加剂；生长因子类如血小板生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGFs）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）等能更好地促进细胞增殖；还有某些脂肪酸如亚油酸和亚麻酸等能更好地促进细胞生长和产物合成。
6）无血清培养基：
目前在哺乳动物细胞培养中普遍使用人工合成培养基，需要补加5%～10%血清，为细胞的生长提供必要的激素、微量元素、酶抑制剂及生长因子等，然而由于血清中的成分复杂，可能含有病毒和支原体及有可能抑制病毒的因素，干扰病毒研究试验，影响到药物的研究。无血清培养基（serum free medium，SFM）是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基，已成为动物细胞培养的趋势。它具有重复性好；避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染及对试验研究的影响；有利于体外培养细胞的分化；可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化等优势。但也存在成本高、针对性强、易受某些因素影响等缺点。由于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种黏附贴壁因子，细胞往往以悬浮形式生长，因此必须添加相关组分如促贴壁物质（细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等）、促生长因子及激素（胰岛素等）、酶抑制剂（大豆胰酶抑制剂等）、结合蛋白和转运蛋白（常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白）及微量元素（硒等）（表4-7）。
表4-7 无血清培养基常用配方
