DNA连接酶（DNA ligase）是催化DNA分子中5'磷酸基与3'羟基间形成磷酸二酯键的酶，DNA连接酶的作用需要ATP和NAD＋作为辅助因子，DNA连接酶的底物可以是DNA/ RNA杂合体中带缺刻的DNA、黏端DNA或平端DNA，连接效率依次降低。DNA连接酶有两种来源，一种是大肠埃希菌的DNA连接酶，以NAD＋作为能源；另一种为T4噬菌体DNA连接酶，以ATP为能源，两种酶作用机制相同。T4 DNA连接酶是从T4噬菌体感染的大肠埃希菌分离得到的，能进行平端DNA片段的连接，因此在基因工程中应用较广泛，连接黏端DNA最佳温度为4～15℃。